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作者：杨赛，刘陶，杨浩，韩锋产， 陈五岭
【关键词】 人巨细胞病毒
Synthesis and identification of CMV branched peptide
【Abstract】 AIM: To investigate the synthesis of human cytomegalovirus antigenic branched peptide. METHODS: The linear peptide and branched multiple peptide with human cytomegalovirus antigenic epitope were synthesized with solid phase chemistry respectively and purified by HPLC. The two peptides molecular masses were obtained by mass spectrum and then identified with quality control serums. RESULTS: The molecular mass of the linear peptide was 793.8 and that of branched multiple antigenic peptide was 7127.77, both consistent with the theoretic molecular mass. The branched peptide differentiated quality control serums properly through ELISA. CONCLUSION: The synthesis of cytomegalovirus antigenic branched peptide greatly facilitates the previous way for the preparation of human cytomegalovirus antigen and has the advantage of low cost and no potential biohazard.
【Keywords】 Solid phase synthesis; Human cytomegalovirus; Branched multiple antigenic peptide
【摘要】 目的： 探讨人巨细胞病毒（HCMV）抗原分支肽人工合成方法. 方法： 用固相合成方法分别合成HCMV抗原表位的线性多肽和分支多抗原肽，经HPLC进行纯化后质谱检验其分子质量，并用质控血清鉴定抗原活性. 结果： 合成的线性肽分子质量为793.87 ku，八分支肽的分子质量为7127.77 ku，均与其理论分子质量相符，分支肽经ELISA初步鉴定对质控血清具有较好的分辨效果. 结论： HCMV抗原分支肽的人工合成大大简化了以往HCMV抗原的制备方法，且制备成本低，无潜在生物危害.
【关键词】 固相合成；人巨细胞病毒；分支多抗原肽
0引言
人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）为已知最大的人疱疹病毒，能通过唾液、性接触、胎盘、哺乳、输血以及器官或干细胞移植等方式感染人类，引起多种疾病［1，2］. HCMV在发达国家的感染率约为30%～70%，在发展中国家则达到了90％以上［3］. 目前，诊断HCMV感染的主要手段为血清学检测法，检测患者血清中抗HCMV IgG， IgM. 我们根据Nejatollahi等［4］以及KyteDoolittle亲水性方案预测B细胞表位结果，设计合成了含有HCMV gp55上的 VTSGSTKD （aa 798 to 805）抗原表位的八分支肽和线性肽，并用质控血清对肽的活性进行了初步鉴定.
1材料和方法
1.1材料
制备型HPLC （Beckman公司）；C18反相色谱柱（25 mm×100 mm，15 μm）（Waters公司）；核酸蛋白检测仪（上海嘉鹏科技有限公司）；激光解析质谱（HEWLETT PACKARD公司）；台式冻干机（军事医学科学院四环仪器厂）； 固相萃取小柱（Waters公司）；芴甲氧羰基（Fmoc）保护的氨基酸（Merck公司）; 1氧3双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐（TBTU ）、1羟基苯并三氮唑（HOBT）（ABI公司）；线性多聚赖氨酸、DIEA、三氟乙酸（TFA）（Sigma公司）；
G10，G25凝胶（Pharmacia公司）；乙腈（Fisher公司）；ELISA微孔板、小牛血清白蛋白（BSA）、羊抗人酶标抗体、邻苯二胺（OPD）（华美公司）；ELISA包被缓冲液为0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.6）;洗涤液为含有0.5 mL/L Tween20的0.02 mol/L的PBS（pH 7.4）；稀释液为含50 mL/L小牛血清的PBST20. HCMV质控血清为第四军医大学全军基因诊断技术研究所提供.
1.2方法
1.2.1线性肽的合成将PACPEGPS树脂 0.5 g（替代度0.2 mmol/g）用NN二甲基甲酰胺（DMF）浸泡30 min进行活化. 采用对称酸酐法将已经活化的树脂进行第一个氨基酸的连接. 称取待连接的氨基酸 195 mg，加入1.5 mL二氯甲烷（DCM）和3滴DMF使之溶解，加入1 mol/L二环己基碳化二亚胺（DCC）/N甲基吡咯烷酮（NMP）275 mL，磁力搅拌，室温下反应15 min，反应完毕，过滤除去沉淀，蒸发掉过滤液中的溶剂，得到对称酐. 将得到的对称酐溶于最少量的DMF中（保证最大浓度），加入到活化的树脂中，摇动1 min，然后加入0.1 mol/L 4二甲氨基吡啶（DMAP）/DMF 460 μL，摇动反应90 min，吹去反应液，用10 mL DMF洗涤3次，吹干.
其余7个氨基酸的连接采用原位活化法，将连接有第一个氨基酸的树脂放入反应瓶中，加入300 mL/L哌啶/DMF溶液50 mL反应15 min，以脱去FMOC保护基团. 取2.0 mmol保护氨基酸，用1 mol/L DIEA/DMF5 mL溶解，加入4.0 mmol TBTU和4.0 mmol HOBT（DMF为溶剂），预反应15～20 min，然后和氨基酸树脂一起反应2 h，吹去反应液，50 mL DMF冲洗3次，吹干.
将已合成好连接有全部氨基酸序列的树脂放入裂解容器中. 按照TFA∶水＝95∶5(V/V)切割试剂，使用时按25 mL切割试剂与1 g树脂反应的比例进行切割，反应时间为2 h. 将反应液快速倒入150 mL乙醚中，收集沉淀，所用乙醚需预先放在低温冰箱中冷却. 将沉淀重新加蒸馏水溶解，再转移到冻干机中冻干.
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1.2.2线性肽的脱盐用5 mL固相萃取小柱，先用蒸馏水、500 mL/L甲醇、蒸馏水各15 mL进行平衡，每次上样0.5 mL（1～2 g/L），用蒸馏水15 mL进行脱盐，按甲醇∶水＝85∶15(V/V)的比例配置洗脱液，15 mL洗脱液进行样品的洗脱，洗脱液冻干后得样品.
1.2.3在分支状多聚赖氨酸支架上用顺序法合成八分支肽将赖氨酸作为第一个氨基酸按1.2.1的方法进行连接. 每次均脱保护15 min以上，偶联60 min. 连接3次，得到八分支多聚赖氨酸骨架，将此支架上的赖氨酸作为合成肽的C端第一个氨基酸，依次进行八肽的连接.
1.2.4在分支状多聚赖氨酸支架上用片段合成法制备八分支肽将分支状多聚赖氨酸做为第一个氨基酸，把已合成并纯化好的线性肽作为待连接的氨基酸按照片断合成法连接到该支架上. 将5.5 mg（0.007 mmol）线形肽和5 mg （0.0007 mmol）线形多聚赖氨酸按照10∶1的比例混合，加PBS缓冲液（pH 7.4）5～10 mL溶解；加少量20 g/L戊二醛进行连接，每10 min加入2 mL,加3～4次，中间要摇晃或者采用磁力搅拌，反应完毕将溶液过G25凝胶柱子，收集，冻干，得到3 mg左右连接好的复合物.
1.2.5八分支肽的脱盐用G25凝胶15 g，溶胀后装柱，装好后的柱子先用蒸馏水50 mL进行平衡，每次上样3～5 mL，蒸馏水进行洗脱，用核酸蛋白检测仪检测220 nm处紫外吸收，按峰收集组分，将第一个峰的组分收集，冻干，成为脱盐的样品，冻干后备用.
1.2.6HPLC纯化多肽用半制备HPLC，洗脱系统为： ① A液： 50 mL/L乙腈/H2O溶液；② B液： 950 mL/L乙腈/H2O溶液. 手动进样，每次1 mL，流速4 mL/min，线性梯度，45 min内. B液从50 mL/L升到500 mL/L，然后5 min内升到950 mL/L，B液做最后洗脱. 220 nm处检测紫外吸收，按峰收集组分，用于质谱检测. 将分子质量检测正确的组分收集，冻干，成为需要的纯品，备用.
1.2.7质谱检验多肽采用激光解析质谱鉴定多肽，数据分析软件为G2025A Software A.02.01，方法严格按照操作手册进行，检测合成多肽的分子质量.
>1.2.8ELISA法鉴定多肽抗原活性将合成的线性肽、分支肽稀释成5 mg/L后取100 μL包被ELISA微孔板，4℃过夜；以100 mL/L的BSAPBS缓冲液37℃封闭1 h；洗涤3次，每次3 min；加入20倍稀释的质控血清，100 μL/孔，37℃温育1 h. 洗涤3次后加入酶标二抗，37℃温育1 h；洗涤3次后加入OPDH2O2底物,37℃, 10 min终止反应. 在酶标仪上测A490 nm值.
2结果
2.1多肽HPLC纯化结果合成的线性八肽的粗品经HPLC纯化后，已去除绝大部分的杂质（Fig 1）.
2.2多肽质谱检验结果实际合成的多肽分子质量为793.87 ku，与理论分子质量793.8 ku相差无几. 与Fig 1进行比较，两个主峰出峰时间近似（Fig 2）. 由Fig 3中可以看出，实际测定的分子质量和合成多肽的理论分子质量7130.77 ku接近.
2.3多肽抗原活性鉴定结果单纯线性肽检测结果普遍偏低，对质控血清无分辨效果，八分支肽对15份阳性及10份阴性质控血清检测结果良好，其中弱阳性血清A490 nm均在1.0以上，大于阴性血清A490 nm的2.1倍，表示八分支肽对质控血清具有较好的分辨能力.
3讨论
单一表位抗原肽特异性强，经抗原抗体结合实验可断定患者有无该种病毒的感染，但由于线性肽分子质量小，空间结构单一，包被ELISA微孔板后未表现出应有的抗原活性，造成在本次实验中A490 nm值普遍偏低，因此既不适合做检测抗原用，也不适合于作为疫苗的免疫原来使用.
八分支肽具有以赖氨酸为核心的放射状分子肽，寡聚赖氨酸分子质量小，免疫原性弱，基本上无特异性免疫应答抗体，此结构在加强了抗原优势表位的肽链结构的特异性的同时还增大了抗原的分子质量，改善了线性肽的空间位阻影响，增加了活性位点，进而改善了其抗原抗体反应的活性，在疫苗开发和肿瘤免疫治疗上有着巨大的应用前景［5,6］. 我们设计合成的HCMV八分支肽可为以后进一步人工合成HCMV肽疫苗打下基础.
【参考文献】
［1］ Sia IG, Patel R. New strategies for prevention and therapy of cytomegalovirus infection and disease in solidorgan transplant recipients ［J］. Clin Microbiol Rev, 2000;13(1):83-121.
［2］ Revello MG, Gerna G. Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother,fetus,and newborn infant ［J］.Clin Microbiol Rev, 2002;15(45):680-715.
［3］ Maher KG,Rajiv K. Human cytomegalovirus: Clinical aspects，immune regulation, and emerging treatments ［J］. Lancet Infect Dis, 2004;12:725-738.
［4］ Nejatollahi F, Samantha J, Hodgetts PJ, et al. Neutralising human recombinant antibodies to human cytomegalovirus glycoproteins gB and gH ［J］ . Med Microbiol Immunol, 2002;3:337-344.
［5］ Markiewicz MA, Kast WM. Progress in the development of immunotherapy of cancer using ex vivogenerated dendritic cells expressing multiple tumor antigen epitopes ［J］. Cancer Invest, 2004;3:317-334.
［6］ Bainbridge J, Jones N, Walker B. Multiple antigenic peptides facilitate generation of antiprion antibodies ［J］. Clin Exp Immunol, 2004;2:298-304.