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作者：曹秀华，王成英，赵士平，程占庆
【关键词】 端粒酶
长期以来普遍认为恶性肿瘤是由破坏细胞正常生长调节的多种基因突变引起的，但随着对恶性肿瘤发病机制研究的深入，发现端粒酶的激活是恶性肿瘤发生的先决条件［1］。
1 端粒、端粒酶
端粒是真核细胞染色体末端的特殊DNA-蛋白质结构，其DNA的特点是含有大量的（TTAGGG）n串联重复并富含G的重复序列。端粒结构功能有2个：一是保护染色体基因组免受被降解或有害重组，二是端粒重复可为染色体末端提供一个可消耗的编码序列。大多数普通体细胞的端粒会随周期性复制而逐渐缩短，最终达到一个使染色体完整性丧失的临界点，细胞增殖停止，细胞进入死亡Ⅰ期（M1期）。此期端粒DNA还相当长，因此正常体细胞增殖有一定的限制［2］。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，含有引物特性和识别位点，能以自身的RNA组分为模板合成DNA的TTAGGG重复序列，并加到染色体的末端以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短。
由于端粒缩短和端粒酶无活性，体细胞通常逐渐衰老死亡。仅有极少数细胞偶然通过激活端粒酶而逃避程序性老化，其生存延长可能给另外的基因损伤的积累提供机会，导致进行性肿瘤的发生［3］。1989年Morin首次在人体的癌细胞中发现端粒酶，随着对肿瘤的研究发现大多数癌细胞系和肿瘤细胞中端粒酶均有高水平表达［4］。表明端粒酶的激活表达与细胞的无限增殖有密切关系。通过解除细胞衰老过程中的增生受限，端粒酶的重新活化可能是体细胞向肿瘤细胞转化的关键步骤。
正常组织细胞需要更新的组织表达低水平的端粒酶，其作用仅是部分补偿末端复制造成的端粒进行性缩短。目前已发现端粒酶表达的正常组织有血淋巴细胞、造血干细胞、生殖细胞、胚胎体细胞、毛发、皮肤、子宫内膜等分裂旺盛的组织。正常外周血单个核细胞表达端粒酶的水平仅为无限增殖的癌细胞的1%～2%［5］。有学者报道正常的肠道黏膜有端粒酶活性，但其水平比癌性细胞黏膜低10～100倍。
2 端粒酶与恶性肿瘤
端粒酶的激活是恶性肿瘤发生的一个共同途径，而端粒酶是各种恶性肿瘤细胞的一个分子标志物，当抑癌基因失活或癌基因激活及DNA病毒（SV40 HPV）转染可使细胞发生转化，超过M1期，而继续分裂，端粒DNA进一步丢失使端粒缩短达到极限，此时期细胞不仅不能无限增殖也不能生存，进入死亡Ⅱ期（M2）［6］。越过这两个阶段的细胞具无限的分裂能力，成为永生细胞。体细胞到达永生化，越过M2期端粒酶的激活合成端粒DNA，阻止端粒丢失，使细胞获得永生。研究表明，大多数肿瘤组织均有较高水平的端粒酶活性表达，恶性肿瘤高达80%，而周围的癌旁组织和正常组织阳性率低于10%，其端粒酶的表达与临床症状无明显关系，而与临床病理学特征有一定联系。Tahara等对105例肝组织（肝癌、慢性肝病、正常肝组织）进行了端粒酶活性的系统检测，结果显示HBV阳性的肝癌端粒酶阳性率100%，慢性肝炎阳性率55%，正常肝组织为阴性，表明端粒酶活性随肝癌的发生、进展而呈进行性升高［7］。Kinoshita等比较一组膀胱肿瘤样品与随意尿、膀胱冲洗脱落细胞的端粒酶表达，结果肿瘤组织样品、膀胱冲洗液、随意尿中端粒酶检出率分别为98%、84%、55%。正常人的膀胱冲洗液没有检出端粒酶［8］。这表明端粒酶检测癌症的敏感性显著高于细胞学检查，对膀胱癌的早期诊断及随访有重要意义。
到目前为止资料提示,端粒酶可检测恶性脑瘤、急性髓性白血病、胃肠道癌症、乳腺癌、肺癌。同时显示高水平的端粒酶活性与预后不良相关［9］。
端粒酶活化在肿瘤发生的哪一个阶段，也是探讨的问题，通过对恶性胃肠癌和前列腺的分析表明，端粒酶活化通常发生在致癌过程的早期阶段，对17例早期胃癌和89例进展期胃癌患者的肿瘤组织端粒活性进行检测发现其阳性率分别为70.6%和85.9%，表达的强度以进展期癌症为最高，同时也说明是肿瘤发生的早期标志物，同时发现端粒酶阳性的病灶明显大于阴性者，晚期明显高于早期。
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3 端粒酶检测的标本来源
在几乎任何一种临床标本中均可对端粒酶活性进行检测，除病理性组织外，脱落细胞和细胞针吸出物、渗出液、胸腹水、胰、胆管、乳房吸出物、口腔、结肠、肺、宫颈冲洗物或刷取物等均可用于端粒酶检测。
4 端粒酶的检测方法
1994年Kim等建立了端粒重复序列扩增法，该方法能使端粒酶催化反应的产物以指数倍数增加，极大地提高了端粒酶活性检测的敏感性，使大规模检测端粒酶活性成为可能［10］。另一种是最早建立的端粒重复序列延伸法。与其他肿瘤标记物相比， ，用端粒酶活性检测进行恶性肿瘤诊断有以下优点：（1）端粒酶是通过维持端粒长度使细胞成为肿瘤细胞，因此，端粒酶活性与恶性肿瘤的关系比其他肿瘤标志物更直接；（2）端粒酶活性广泛存在于恶性肿瘤细胞，而通常良性肿瘤和正常体细胞中无活性，因此用端粒酶活性诊断恶性肿瘤具有高度特异性；（3）只要测定体系中含有3个恶性肿瘤细胞，即可用端粒重复序列扩增方法检测端粒酶的活性，因此，端粒酶活性检测的灵敏度高，检测所需标本少［11］。
4.1 端粒重复序列扩增法其原理是将端粒延伸与PCR技术结合 （1）首先制备S-100细胞提取液。（2）端粒重复序列延伸，取微量细胞提取液，加入TS（telomerase substract）引物，端粒酶可与TS结合，并在其3’端合成延伸TTAGGG重复序列。（3）加入CX引物Taq酶进行PCR反应。CX是24bp寡核苷酸与端粒重复序列互补结合，在反应中加入a-32pdcTP，使其掺入，进行放射后显影。
4.2 端粒重复序列延伸法是根据端粒酶能合成延伸端粒特性而设计的 先制备S-100细胞提取液。而后进行端粒序列合成，加LTTAGGG3引物，模拟正常端粒，端粒酶以此为引物合成延伸TTAGGG重复序列。反应中加入2mMdATP、mMdTTP、3mMa-2pdcTP使同位素掺入，并且30℃延伸6min后用0.1mg/ml RNA酶终止。最后电泳放射后显影。
综上所述，端粒酶已成为当前恶性肿瘤的最引人注目的生物标志物之一。但由于端粒酶的蛋白质成分尚未完全分离成功，端粒酶中蛋白质与RNA何者决定酶活性，端粒酶在肿瘤中如何激活等问题尚未解决，要将端粒酶检测和端粒酶抑制剂全面应用于临床，还有待于进一步的深入研究。
【参考文献】
1 Rubin H.The disparity between human cell senescence in vitro and lifelong replication in vivo.Nat Biotechnol,2002,20(7）:675-681.
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8 邹学森，吴时耕.端粒酶作为肿瘤标志物的研究进展.国外医学・免疫学分册，1999，1：22-24.
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10 Kamaradt J,Drosse C,Kalkbrenner S,et al.Telomerase activity and telomerase subunrit gene expression levels are not related in prostate cancer:a real-time quantification and in situ hybridization study.Lab Lnvest,2003,83(5）:623-633.
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