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【关键词】 肠炎沙门菌；随机扩增多态性DNA(RAPD)；分型
摘要： 目的 对不同来源的12株肠炎沙门菌分离株进行分子分型。方法 分别提取不同菌株基因组DNA，建立和优化随机扩增多态性DNA(RAPD)反应体系,试用22条随机引物对不同菌株进行RAPD扩增，筛选清晰稳定的扩增条带做统计分析。结果 筛选到OPG-03、OPG-06、OPG-07和OPG-13共4条随机引物具有鉴别作用，每一菌株均可扩增出4～10条DNA片段，大多数片段在100～2000bp之间，共扩增出42条RAPD条带，其中共有条带7条，多态性条带35条，多态性为833%。不同来源的肠炎沙门菌分离株之间的遗传相似系数在426%～100%之间，在0850的相似性水平上可将12株肠炎沙门菌分离株分为5个不同的亚型。结论 应用RAPD技术在分子水平上对肠炎沙门菌进行鉴别和分型具有简便、快速和辨别能力高的优势，对肠炎沙门菌的分子流行病学研究具有较好的应用前景。
关键词： 肠炎沙门菌；随机扩增多态性DNA(RAPD)；分型
Application of RAPD in molecular typing Salmonella enteritidis isolates
Abstract： Objective Molecular typing 12 strains of the Salmonella enteritidis isolated from different origins.Methods The genomic DNA of different Salmonella enteritis strains were extracted and random amplified polymorphic DNA (RAPD) system was developed and optimized.22 random primers were tested to the analysis on 12 strains of Salmonella enteritis isolated from different sources,and the clear and constant fingerprints were selected for statistical analysis.Results 4 effective primers named OPG-03,OPG-06,OPG-07 and OPG-13 were selected,with which each strain could be amplified 4 to 10 DNA fragments of 100bp～2000bp.42 RAPD bands were amplified,833 % of them being polymorphic.The comparative research of the cluster analysis based on the RAPD bands spectra showed that the similarity coefficient between two different strains varied from 426% to 100%,and 12 Salmonella enteritis strains in this experiment could be classified to 5 groups according to their genetic relationship.Conclusion Using RAPD to subtype and character Salmonella enteritis at molecular level is more rapid and sensitive than other typing methods,which indicate broad future of application.
Key words： Salmonella enteritis;RAPD;type
菌株分型对肠炎沙门菌的流行病学调查，以及研究其感染和传播机制具有重要意义。随机扩增多态DNA（Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD）具有操作简便、快速、敏感及不需先了解目的基因的核酸序列等优点，目前广泛应用于微生物的分子分型和鉴定、物种亲缘关系的确定及分子流行病学等领域的研究［1-3］。本研究应用RAPD技术对12株不同来源的肠炎沙门菌进行分子分型，分析指纹图
图谱对其鉴别的价值并确定不同菌株间亲缘关系，为肠炎沙门菌食源性疾病预防控制和鉴别诊断提供新方法。结果报告如下。
1 材料与方法
11 材料 (1)菌株与来源: 12株肠炎沙门菌分别来自病人分离株4株（菌株号为SEWX01～04），生猪肉分离株2株（菌株号为SEWX05，06），熟食样品分离株1株（菌株号为SEYZ08），鸡分离株3株（菌株号为SEYZ11～13），生鸡肉分离株2株（菌株号为SENT19，20）。(2)酶与试剂: Taq DNA 聚合酶, DNA Marker，dNTPs (大连宝生物工程有限公司)；溶菌酶,蛋白酶K，RNA酶,Sarkosyl(上海申能博彩生物工程公司)；其他试剂均为国产分析纯。(3)随机引物: 22条随机引物（编号为OPG-01～OPG-22）由上海申能博彩生物工程公司合成,均为10bp，经筛选用于分型的共有4条，分别为: OPG-03：5′-AATCGGGCTG-3′；OPG-06：5′-CGGCCCCTGC-3′； OPG-07：5′-GGATCCTGAC-3′；OPG-13：5′-CAGCTCCTGT-3′。
12 方法
121 基因组DNA提取 挑取单菌落接种100ml乳糖发酵(LB)培养基，37℃震荡培养18h，4℃冷却；6000r/min离心15min，去上清，用预冷三羟甲基氨甲烷(TE)缓冲液洗涤和重悬菌体至3ml；加04ml溶菌酶（10g/L），37℃温浴10min；加04ml 30% Sarkosyl溶液在70℃和37℃分别作用20和60min；加蛋白酶K，56℃作用2h；经苯酚多次抽提后加RNA酶37℃作用6h；苯酚抽提直至水相澄清；用无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤1次，自然干燥后溶解于1ml TE缓冲液。取10μl DNA样品用1%的琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的完整性；取50μl DNA稀释到500μl，测定吸光度A260nm和A280nm检验纯度并计算DNA浓度。
122 PCR扩增 在总体积为25μl的反应体系中包含基因组DNA 50ng作为模板，25μl 10×PCR反应缓冲液，25mmol/L Mg2+，Taq酶15U，200μmol/L dNTPs，25pmol随机引物，双蒸水空白做阴性对照；循环参数为：93℃ 2min，36℃ 1min，72℃ 2min 1次循环；93℃ 1min，36℃ 1min，72℃ 2min，40次循环；93℃ 1min，36℃ 1min，72℃ 10min 1次循环。扩增结束后取10μl产物在14％的琼脂糖凝胶上电泳(电压5V/cm) 15h，经溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统上观察并拍照记录。
123 RAPD多态性谱带确定与分析 对12株肠炎沙门菌分离株进行RAPD扩增，每次实验重复2次,筛选多态性和重复性较好的扩增条带做统计分析。将12个菌株对应的同一电泳迁移位置上扩增条带按"1"和"0"进行统计，建立数据矩阵。按Nei等［4］公式F=2Nxy/(Nx+Ny)计算不同菌株间的遗传相似系数，其中F是菌株x和y的遗传相似系数, Nxy是菌株x和y共同具有的条带数, Nx是菌株x扩增的条带数, Ny是菌株y扩增的条带数。根据遗传相似系数利用类平均法(UPGMA法)进行聚类分析。
2 结果
21 模板DNA提取（图1） 纯度检测结果表明, 提取的基因组DNA的A260nm/A280nm在18～20范围内，符合模板DNA的纯度要求。基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果表明,基因组DNA条带均一，未见断裂和降解现象，DNA模板完整，可以用于RAPD分析。
M:DNA marker(λDNA/HindⅢ);1:SEWX01;2:SEWX02;3:SEWX03;4:SEWX04; 5:SEWX05; 6:SEWX06;7:SEYZ08;8:SEYZ11;9:SEYZ12;10:SEYZ13;11:SENT19; 12:SENT20
图1 基因组DNA凝胶电泳结果（略）
22 随机引物筛选(表1) 利用22条随机引物分别对12株肠炎沙门菌基因组DNA进行RAPD扩增。结果显示，随机引物OPG-01、OPG-02、 OPG-04、OPG-10、OPG-19没有扩增出任何条带；随机引物OPG-05、OPG-08、OPG-09、 OPG-11、OPG-12、OPG-14～OPG-18、OPG-20～OPG-22能够扩增出条带，但扩增的指纹图谱中没有多态性条带；而随机引物OPG-03、 OPG-06、OPG-07、OPG-13条引物可以扩增出较好的多 态性条带。
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23 肠炎沙门菌RAPD指纹图谱(图2) 利用4条具有多态性条带的随机引物分别对12株肠炎沙门菌分离株进行RAPD分析。结果可见，不含模板DNA的空白对照，没有扩增出任何产物；含肠炎沙门菌基因组DNA模板均能够产生较丰富的DNA片段，并在不同来源肠炎沙门菌之间具有较好的多态性，每一引物可扩增4～10条DNA片段，大多数分子量在100～2000bp之间。共检测42个位点,其中35个为多态标记,占833%。结果显示，不同的菌株扩增的条带模式存在一定的差异，表明不同菌株在基因组DNA的碱基序列上具有差异性，据此可以在核酸序列水平将不同的菌株区别开来。
表1 筛选得到的有效随机引物的序列及其扩增多态性（略）
24 菌株聚类分析与分型 （1）对不同菌株的RAPD指纹图谱进行统计分析并计算遗传相似系数。结果显示，12个肠炎沙门菌分离株之间的遗传相似系数在0426～1000之间，其中SENT19与SENT20和SEWX03与SEWX04之间的相似系数为1000，表明SENT19与SENT20之间和SEWX03与SEWX04之间具有高度的同源性，本文22条随机引物尚无法区别其差异。SEWX05和SEWX03与SEWX04的相似系数最小，为0426，表明它们之间的DNA差异性最大。(2)以遗传相似系数085为阈值，12株肠炎沙门菌可以划分为5个亚型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ），亚型Ⅰ分离株包括SENT19、SENT20、SEWX06、SEYZ11和SEYZ12等5株，其中2株分离自活鸡，2株分离自生鸡肉，1株分离自生猪肉；亚型Ⅱ包括SEYZ08和SEYZ13等2株，其中1株分离自熟食样品，另1株分离自活鸡；亚型Ⅲ包括SEWX03和SEWX04，亚型Ⅳ包括SEWX01和SEWX02，均为分离自肠胃炎患者便样；亚型Ⅴ只有SEWX0511株，分离自生猪肉。相同亚型的菌株之间遗传相似系数较高，表现出较高的同源性；不同亚型之间遗传相似系数较小，表现出较大的遗传距离，亲缘关系较远，其中以SEWX05与其他菌株之间遗传差异最大。
M:DNA marker(DL2000);N:Negtive contrast;1:SEWX01;2:SEWX02;3:SEWX03;4:SEWX04;5:SEWX05;6:SEWX06;7:SEYZ08;8:SEYZ11;9:SEYZ12;10:SEYZ13;11:SENT19;12:SENT20
图2 4条随机引物对12株肠炎沙门菌的RAPD指纹图谱（略）
3 讨论
在沙门菌的流行病学研究中,人们引入了多种分型方法,包括表型分型和基因分型。表型分型如血清分型、噬菌体分型和质粒分型等方法,其分辨力均较基因分型差。在基因分型中较好的方法为核糖分型和脉冲场凝胶电泳,但实验花费较大,后者还需昂贵的实验仪器。RAPD技术目前在种属特异性鉴定及基因水平种内分型与亚分型中已得到高度重视和广泛应用。RAPD方法所受的影响因素较多,需对反应成分和反应条件进行优化,首先筛选合适的引物,优化反应成分,尤其是镁离子浓度、引物量、dNTPs量和模板量以及循环参数。本实验选取模板、引物、dNTPs和Mg2+作为4个因素，每个因素取3个水平，设计4因素3水平正交实验，采用25μl反应体系进行多次不同循环参数的扩增对反应条件进行优化（结果未在文中列出）。本研究中PCR采用热启动,并使每次?操作条件尽量保持一致,每次反应均设阴性对照(即反应体系中不加模板)，得到了稳定的实验结果。RAPD用于研究沙门菌分型方面有较多报道。邓志爱等［5］利用一条引物将2004年广州市3起肠炎沙门菌食源性疾病分离的20株菌株和来源于从业人员健康体检的18株肠炎沙门菌分为3个类群。李淑梅等［6］从20条随机引物中筛选出10条引物可将5株同一血清型的鸭沙门菌区分出不同的菌株；Athona等［7］单独使用RAPD分析法,只用6个随机引物就可将29株肠炎沙门菌分为14个亚型。本研究从22条随机引物中筛选出4条有效引物，建立并优化了RAPD系统，将分离自不同样品的12株肠炎沙门菌分成5个亚型，为肠炎沙门菌分子流行病学研究提供基础数据。
参考文献
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