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作者：何兵，冯文宇，田吉，李春红，艾洪兵
【摘要】 目的建立黄金咽喉片中柠檬酸的薄层鉴别及含量测定方法。方法采用薄层色谱法对柠檬酸进行定性鉴别，并采用高效液相色谱（HPLC）法测定柠檬酸的含量，色谱柱为：Dikma Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为，乙腈-0.1％磷酸0.1％三乙胺溶液（1∶99）；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；流速：0.6 ml?min-1；进样量：10 μl 。 结果在薄层层析色谱中能检出柠檬酸，柠檬酸在1.04～10.4 μg范围内具有良好的线性关系（r＝0.999 9），平均回收率为98.85％，RSD 为0.37％。结论该方法简便、快速、有效、灵敏、准确，具有良好的重复性和回收率，可作为该制剂中柠檬酸的定性与定量分析方法。
【关键词】 黄金咽喉片 柠檬酸 薄层鉴别
Abstract：ObjectiveTo establish the method for the TLC identification and content determination of citric acid in Huangjin Yanhou Tablet．MethodsCitric acid in Huangjin Yanhou Tablet was identified by TLC, and the content of citric acid was detected by HPLC．The separation was carried out on a Dikma Kromasil C18 column（250 mm×4.6mm，5 μm）．The mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid 0.1% triethylamine solution（1∶99）. The detection wavelength was set at 210 nm，the column temperature was 25℃，the flow rate was 0.6 ml?min-1 and the sample size was 10 μl．ResultsCitric acid could be detected by TLC， the calibration curve showed good linearity over the range of 1.04-10.4 μg（r＝0.999 9）. The average recovery was 98.85％ with RSD 0.37％。论文学术科研网ConclusionThis method is simple，rapid，efficient，sensitive，accurate and with good repeatability and recovery，it can be used as a quantitative analysis method for this preparation．
Key words：Huangjin Yanhou Tablet; Citric acid; TLC identification
黄金咽喉片是由青蒿（黄花蒿）、金银花、乌梅、青果、甘草和薄荷 6 味中药提取的有效部位及有效成分组成的复方制剂，具有芳香透邪、清热解毒、生津润燥、利咽止痛等功效。临床上主要用于治疗急慢性咽炎、喉炎、扁桃体炎、口腔黏膜溃疡；亦可辅佐治疗细菌或病毒感染的其他呼吸道疾病。柠檬酸为乌梅中的主要活性成分，为完善其质量控制标准，本文采用薄层色谱法对乌梅中所含的主要成分柠檬酸进行定性鉴别，并采用高效液相色谱法对其进行定量测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器戴安高效液相色谱仪（P680A四元低压梯度泵，PDA-100二极管阵列检测器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱工作站）；瑞士Precisa电子天平（XR 205SM-DR）；CQX25-06超声波清洗器（上海必能信超声有限公司，功率250 W，频率25 kHz），硅胶G薄层预制板（青岛海洋化工厂）。
1.2 对照品柠檬酸（111679-200401），中国药品生物制品检定所提供。在选定色谱条件分离后,未见其他杂质峰，含量以100 %计。
1.3 试药乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
1.4 样品黄金咽喉片及阴性对照样品，泸州医学院药学院药物研究所提供，规格每片0.5 g，批号 051212，05 51213，051214。
2 方法与结果
2.1 薄层鉴别
2.1.1 试液的制备
对照品溶液：取柠檬酸对照品，加醋酸乙酯制成浓度为2 mg?ml-1 的溶液，作为柠檬酸对照品溶液。
供试品溶液：取本品 2 片，研细，加入酸性醋酸乙酯溶液（醋酸乙酯-甲酸=95∶5）20 ml，超声处理15 min ，滤过，滤液蒸干，残渣加醋酸乙酯2 ml 使溶解，即得。同法制得3批样品的供试品溶液。
阴性对照液：取按处方比例及制备工艺制得缺乌梅提取物的阴性对照样品，按供试品溶液制备项下方法制成阴性对照溶液。
2.1.2 薄层层析照薄层色谱法［1］试验，吸取上述溶液各6 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异丙醚-甲醇-甲酸-水(30∶4∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.1％的溴酚蓝乙醇溶液，置日光下检视。供试品色谱中，蓝紫色背景下，在与柠檬酸对照品色谱相应的位置上，显相同黄色的斑点，阴性对照无此斑点。结果见图1。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件
色谱柱为Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1％磷酸0.1％三乙胺溶液（1∶99）；检测波长 210 nm；柱温 25 ℃；流速 0.6 ml?min-1；进样量10 μl。
2.2.2 试液的制备对照品溶液：取经五氧化二磷减压干燥至恒重的柠檬酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加水制成每毫升含柠檬酸0.5 mg的溶液，即得。 供试品溶液：取重量差异项下的本品20片，精密称定，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50 ml，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
阴性对照溶液：取按处方比例及制备工艺制得不含乌梅提取物的阴性对照样品，按供试品溶液制备项下方法制成阴性对照溶液。
学术科研网 2.2.3 系统适应性实验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、缺乌梅提取物的阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见图2。从图2中可见，柠檬酸的保留时间约为 15.5 min，柠檬酸峰与其前后色谱峰的分离度分别为1.78，3.61，拖尾因子为 1.04，理论塔板数以柠檬酸峰计为14 198，柠檬酸峰纯度因子为 997，阴性对照在柠檬酸峰处无干扰，即本试验条件下柠檬酸与其他组分分离完全。
2.2.4 线性关系考察分别精密吸取柠檬酸对照品溶液（0.52 mg?ml-1）2，4，6，8，10，15，20 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积A对进样量C（μg）进行回归，得标准曲线方程：A＝1.8162C + 0.0325，r＝0.999 9。结果表明，柠檬酸在1.04～10.4 μg范围内，峰面积与进样量有良好的线性关系。
2.2.5 精密度实验
精密量取对照品溶液制备项下对照品溶液10μl，重复进样 5 次，柠檬酸峰面积平均值为9.401 8，RSD为0.17％（n＝5），表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验取本品（批号051214）的供试品溶液，室温下放置，分别于0，2，4，6，8，10，12，24，36 h测定，柠檬酸的峰面积平均值为3.867 5，RSD为0.15％（n＝9），表明供试品溶液在36 h内稳定。
2.2.7 重复性实验取同一批样品（批号051214），照供试品溶液制备项下方法，平行制备5份供试品溶液，分别测定，测得柠檬酸平均含量为21.358 0 mg?g-1，RSD为0.13％（n＝5），表明本法重复性良好。
2.2.8 回收率实验精密称取已知含量（21.3580 mg?g-1）的本品（批号051214）细粉9份，每份0.5 g，分成3组，每组2份，分别精密添加柠檬酸对照品溶液（2.68 mg?ml-1）3，4，5ml，照供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，并计算回收率。结果见表1。实验结果表明，本法具有良好的回收率。表1 样品回收率实验测定结果（略）
2.2.9 样品的测定分别精密量取对照品溶液和供试品溶液10μl，按上述色谱条件测定。结果见表2。表2 黄金咽喉片中柠檬酸含量测定结果（略）
3 讨论
在鉴别乌梅提取物中的柠檬酸时选用了 4 个展开系统，乙醚-氯仿-甲酸-甲 醇（5∶2∶1.5∶0.5）［2］、乙酸丁酯-甲酸-水（4∶2∶2）［3］、正丁醇-醋酸-水（4:1:5）［4］、异丙醚-甲醇-甲酸-水(30∶4∶4∶1) ［5］，结果前3个展开系统分离效果均不如第4个展开系统。显色剂曾比较了 1％ 三氯化铁乙醇溶液、10％ 硫酸乙醇溶液、0.1％甲基橙乙醇溶液、0.1％ 溴甲酚绿乙醇溶液及 0.1％ 溴酚蓝乙醇溶液。结果前 3 种显色剂斑点均不明显，而喷以 0.1％ 溴甲酚绿乙醇溶液在蓝色背景下显黄色斑点，0.1％ 溴酚蓝乙醇溶液在蓝紫色背景下显黄色斑点。两种显色剂效果均较好，但蓝紫色背景下的黄色斑点对比度更强，故选用 0.1％ 溴酚蓝乙醇溶液作显色剂。由于是采用酸碱指示剂显色，而展开剂中含有甲酸，故在喷显色剂前宜用电吹风热风档把甲酸挥尽（置干燥箱中 120℃ 烘烤，效果并不理想）。薄层板下沿由于长时间浸泡在展开剂中，甲酸不易挥尽，可遮住薄层板上沿斑点部分，用氨气薰一下薄层板下沿黄色部分即可。
试验中针对配制供试品溶液的不同提取方法（超声、回流及溶剂萃取），不同提取溶剂（甲醇、75％甲醇、50％甲醇、25％甲醇、水和流动相），不同溶剂体积（10，25，50，75，100 ml）及不同提取时间（15，30，45，60 min）分别考察。结果以50 ml 水超声提取30 min含量最高，杂质峰较少。
采用二极管阵列检测器在 190～380 nm 范围内分别扫描对照品、样品溶液中柠檬酸峰的紫外吸收，结果柠檬酸峰为末端吸收，其最大吸收峰在 190 nm，在 210 nm 左右处有一拐点，250nm 处已基本无吸收，为避免与其他杂质的干扰，测定波长选择在210 nm。
在流动相选择试验中，考察了0.01 mol?L-1 磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH为2.7）［6］；0.5％磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节pH 2.8）［7］；甲醇-0.1％磷酸溶液（5∶95）；乙腈-0.1％磷酸0.1％三乙胺溶液（1∶99）等的不同比例、流速及柱温。试验发现流动相以乙腈-0.1％磷酸0.1％三乙胺溶液（1∶99），流速为0.6 ml?min-1，柱温为25 ℃时保留时间适宜，分离效果最理想，故采用此流动相。
实验采用薄层色谱法对黄金咽喉片中柠檬酸进行定性鉴别，并采用 HPLC 测定其含量，结果准确可靠，精密度好，具有良好的重复性和回收率，可用于该制剂中柠檬酸的质量控制。
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