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作者：陈四利，张冲，李嘉诚，冯玉红 张亚男，张德拉
【摘要】 目的研究萃取迷迭香中迷迭香酸的优选工艺条件。方法利用超临界CO2流体萃取技术，设计4因素3水平正交实验，结合高效液相色谱法对迷迭香酸进行定量分析。结果确定优选工艺条件为：萃取压力40MPa，萃取温度65℃，萃取时间1 h，夹带剂(乙醇)用量为0.60 ml?g-1。 结论该方法可靠性高、简便，可用于迷迭香中迷迭香酸的提取。
【关键词】 超临界CO2萃取； 高效液相色谱； 迷迭香
Abstract：ObjectiveTo study a new extraction process of components from Rosmarinus officinalis L. MethodsBy supercritical CO2 fluid extraction (SFE- CO2). The content of rosmarinic acid in the extract was tested by HPLC. ResultsThe optimum extraction process conditions were as follows: keeping pressure at 40 MPa and temperature at 65℃ for 1h, in the same time adding alcohol 0.60 ml?g-1. CondlusionThe established method is simple and reliable for the extration of rosmarinic acid in Rosemarinus officinalis L.
Key words：Supercritical CO2 fluid extraction; HPLC; Rosmarinus officinalis L.
迷迭香Rosmarinus officinalis L.，系唇形科（Labiatae）迷迭香属植物。论文学术科研网原产地中海地区,现在世界各国广泛栽培。1981年由中国科学院植物研究所北京植物园引入我国［1］。目前，我国南方已广为栽种。迷迭香酸是在1958年由Ellis首次从迷迭香中分离得到，主要存在于唇形科?p紫草科?p葫芦科?p椴树科?p伞形科的多种植物中［2］，是一种天然抗氧化剂，具有抗炎、抗血栓、抗血小板凝集、抗病毒和抗菌等活性［3］，而且有很好的自由基清除和抗氧化作用，能抑制内皮细胞调节的低密度脂蛋白的氧化［4］。在药物应用上，德国Nattermann公司已将迷迭香酸作为解热、镇痛、抗炎药在市场上销售［5］。迷迭香酸属多酚类化合物，结构不稳定［6］，并且目前从迷迭香中提取迷迭香酸常用有机溶剂法，方法非常繁琐，通常还会有溶剂残留。超临界萃取技术是一种集提取、分离、浓缩为一体的新技术［7］，具有工艺过程简单、选择性强、无溶剂残留、不破坏物质活性等优势。
本实验采用超临界CO2萃取技术，通过设计正交实验优选萃取工艺，并用高效液相色谱法对萃取物中的迷迭香酸进行定量分析。
1 器材
1.1 仪器Spe- ed超临界萃取仪（美国ASI）；Waters高效液相色谱仪：Waters 2695 Separations Module, Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector（美国Waters）；超声波清洗器（大连华洋科技有限公司）；LABOROTA 4000旋转蒸发仪（德国Heidolph）；电子天平（SHIMADZU）。
1.2 材料 迷迭香（购自福建）；液体CO2（广东佛山科的气体公司）；迷迭香酸对照品（纯度97％，天津一方科技有限公司）；甲醇（色谱纯，美国TEDIA）；甲酸，乙醇（分析纯，广州化学试剂厂）；双蒸水。
2 方法
2.1 超临界CO2萃取超临界萃取受很多因素的影响，根据设备情况，选取萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂4个对萃取效率有较大影响的因素，设计4因素3水平正交实验，以优选超临界CO2萃取迷迭香酸的工艺参数。因素水平表见表1。
表1 正交实验因素水平（略）
称取100 g迷迭香干叶，装入萃取釜，在一定压力和温度下进行超临界CO2萃取，以乙醇作为夹带剂，萃取完毕，收集萃取物，备用。
2.2 迷迭香酸测定方法
2.2.1 色谱条件色谱柱Waters C18（3.9 mm×150 mm）；流动相为甲醇－0. .1％甲酸溶液（45∶55 V/V），流速1.0 ml/min；波长330 nm，AUFS 1.000 0，柱温25℃。
2.2.2 标准溶液配制 准确称取迷迭香酸标准品5.0 mg，置于25 ml棕色容量瓶中，甲醇超声溶解定容，置于冰箱中避光保存，备用。
2.2.3 标准曲线制作 分别设定进样量为0.5，1，2，4，8 μl，自动进样，按上述色谱条件测定色谱峰的积分面积，以标准品的进样量X（μg）对色谱峰的积分面积Y进行线性回归，得到回归方程：Y=2 450 240X－40 465.75（r＝0.999 8），线性范围为：0.097～1.552 μg。见图1。
图1 迷迭香酸标准曲线（略）
2.2.4 样品分析方法将不同条件下的试样定容于50 ml棕色容量瓶中，甲醇超声溶解，经0.45 μm微孔滤膜过滤，在上述色谱条件下，分别进样20 μl，外标法定量，测定各条件萃取物中迷迭香酸的含量。
2.2.5 精密度实验 按上述色谱条件，吸取迷迭香酸标准品溶液5 μl，重复进样5次，测定迷迭香酸的峰面积积分值，峰面积积分值RSD相对标准偏差为0.66％。
3 结果
3.1 正交实验结果分析超临界萃取的主要影响因素。
3.1.1 萃取压力萃取的压力是超临界CO2萃取过程中最重要的参数。压力大小是影响CO2流体溶解能力的关键因素之一，增加压力将提高CO2流体的密度，因而具有增加其溶解能力的效应，在CO2临界压力附近，压力的微小变化会引起密度的急剧改变，超过一定的范围压力CO2流体的密度影响变缓，对于不同的物质，其萃取压力有很大的不同。
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3.1.2 萃取温度萃取温度也是影响超临界CO2萃取的重要参数。温度对溶解度的影响存在有利和不利两种趋势。一方面，温度升高，超临界流体密度降低，其溶解能力相应下降，导致萃取数量的减少；但另一方面，温度升高使被萃取溶质的挥发性增加，这样就增加了被萃取物在超临界气相中的浓度，从而使萃取数量增大。
3.1.3 萃取时间萃取时间主要是从对设备以及样品的损耗?p经济和萃取效率方面考虑。
3.1.4 夹带剂超临界流体萃取的溶剂大多数是非极性或弱极性，对亲脂类物质的溶解度较大，对较大极性的物质溶解度较小。针对这一问题，在纯的超临界流体如超临界二氧化碳中加入一定量的极性成分(即夹带剂)可显著地改变超临界二氧化碳流体的极性，拓宽其适用范围。
根据原料和设备情况，选取萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂4个对萃取效率有较大影响的因素，设计4因素3水平正交实验，根据选定的L9(34)正交表安排实验，并对结果进行极差分析。见表2。
从极差分析可以看出，各因素对迷迭香酸得率的影响程度依次为A＞B＞C＞D，优选萃取工艺为A3B2C1D3，即：萃取压力40MPa，萃取温度65℃，萃取时间1h，夹带剂用量为0.60 ml?g-1。
萃取压力对结果影响最大。压力增大，超临界CO2流体的密度增大，有利于成分的溶出。压力K值表明，压力由20 MPa增加到30 MPa时，萃取结果无明显变化，压力由30 MPa增加到40 MPa时，萃取结果明显增大。
表2 L9(34)正交实验结果（略）
萃取温度对结果影响也较大。温度升高，流体的传质速率增大，利于传质；温度升高，被萃取物质的挥发性增大，有利于物质的溶出。温度K值表明，温度由55℃增加到65℃时，萃取结果明显增大，温度由65℃增加到75℃时，结果反而减小。这是由于温度增加的同时，CO2流体的密度也随之减小，对萃取产生负效应。萃取时间的影响仅次于萃取温度。
夹带剂的影响最小，迷迭香酸属于高极性化合物。乙醇由于无毒等优点，是常用的夹带剂。本实验采用乙醇为夹带剂，随乙醇用量增大，超临界CO2流体的极性增大，有利于迷迭香酸的溶出。
3.2 验证实验为进一步考察方法的可靠性，称取100 g迷迭香干叶，按照正交实验所得优选萃取工艺进行萃取，共进行3次平行实验，测得迷迭香酸的提取率分别为：0.028 79％，0.028 87％，0.028 81％，RSD为0.17％，证明本法可靠性高。
4 结论
采用超临界CO2萃取技术可以实现迷迭香中迷迭香酸的提取。4因素影响大小为：萃取压力＞萃取温度＞萃取时间＞夹带剂，优选工艺条件为A3B2C1D3，即：萃取压力40 MPa，萃取温度65℃，萃取时间1 h，夹带剂用
量为0.60 ml?g-1。
本工艺可靠性高，工艺简单，不存在有害物质污染，符合绿色环保发展趋势，值得进一步优化和研究，具有广阔的应用前景。
【参考文献】
［1］ 王文中，王 颖.迷迭香的研究及其应用——抗氧化剂［J］.中国食品添加剂，2002，5：60.
［2］ 陈慧芳，马永华，卞学伟.植物活性成分词典，第2册［M］.北京：中国医药科技出版社，2001：888.
［3］ 吴建章，郁建平，赵东亮.迷迭香酸的研究进展［J］.天然产物研究与开发，2005，17（3）：383.
［4］ Pearson DA , Frankel EN, Aeschbach R ,et al. Inhibition of endothelial cell mediated oxidation of low density lipoprotein by rosamrary and plant phenolics［J］.Agric Food Chem, 1997, 45(3):578.
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