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作者：吴若岚 张端莲 喻小红
【摘要】 目的：观察心先安对缺血预处理心肌细胞组织中p53蛋白表达的影响，探讨心先安对缺血再灌注损伤心肌细胞的保护机制。方法:将35只SD大鼠随机分成4组:正常对照组（n=5）、假手术组（n=10）、缺血再灌注损伤组（n=10）、心先安预处理组（n=10），建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色，观察各组动物心肌细胞内p53蛋白表达的变化。利用HPIAS-1000图文报告管理系统对p53抗原的表达进行定量分析，测定各组中p53蛋白表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细胞内p53蛋白表达呈阴性，心先安预处理组心肌细胞内p53蛋白表达呈阴性；假手术组心肌细胞内p53蛋白表达呈阴性，缺血再灌注损伤组p53蛋白表达呈阳性。论文学术科研网图像分析结果显示，正常对照组、心先安预处理组、假手术组与缺血再灌注损伤组之间p53蛋白的平均光密度和阳性面积率的差异有显著性意义（P<0.01）; 正常对照组与假手术组之间、心先安预处理组与假手术组之间p53蛋白的平均光密度和阳性面积率的差异无显著性意义（P>0.05）。结论：心先安注射液预处理对大鼠缺血再灌注损伤心肌具有保护作用。
【关键词】 心先安 缺血再灌注 心肌 p53蛋白
随着社会老龄化和心血管疾病的高发，围术期恶性心血管意外已成为威胁手术病人生命的第一杀手，也严重影响了麻醉医生的工作安全。如何预防围术期恶性心血管意外以及如何减轻缺血事件发生后心肌细胞的损伤，成为临床医生关心的焦点。心先安（即环磷腺苷葡胺注射液）是环化腺苷酸（cAMP）的衍生物，参与心肌细胞的能量代谢，提供外源性cAMP，对维持心肌细胞氧耗的供需平衡有积极意义，目前研究表明心先安预处理可减少缺血再灌注损伤心肌细胞的凋亡，具有一定保护意义。
p53基因为一抑癌基因，目前研究表明p53基因与细胞凋亡有着密切关系，观察心肌细胞内p53蛋白的表达可以了解细胞受损程度。
本实验采用免疫组织化学方法观察了心先安对缺血再灌注损伤心肌的保护作用，为缺血再灌注损伤心肌的治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
选用健康雄性Wistar大鼠（SPF级）35只,体重250～300g左右。腹腔注射戊巴比妥钠4.5 mg?(100 g)-1 ,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸［呼吸频率60 次?min-1 ,潮气量2ml?(100g)-1］,沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/ 开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成四组: 正常对照组（不做任何处理）；假手术组（丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎）；缺血再灌注损伤组(IR)（ 缺血/ 再灌注前静脉注射生理盐水0.8ml / kg，结扎左冠状动脉前降支45min ,再灌注120 min ）；心先安注射液预处理组（在结扎前20min，静脉注射心先安注射液0.8ml/kg , 其它处理同缺血/ 再灌注组）。
1.2 主要试剂
心先安注射液（环磷腺苷葡胺注射液），江苏万邦生化医药股份公司。即用型兔抗鼠p53单克隆抗、 即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸，以上试剂均购于北京中山生物技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 常规HE染色
1.3.2 免疫组织化学S-P法检测p53相关抗原 5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，p53均采用高压抗原修复，正常羊血清处理10 min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10 min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，人乳腺癌作为p53的阳性对照组。
1.4 免疫组织化学结果判断
p53以细胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对p53抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
1.5 统计学处理
对
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和q 检验，检验水准α为0.05。
2 结果
2.1 HE染色
正常对照组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核位于细胞中央，细胞界限清晰，结构正常；假手术组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，但可见部分胞浆溶解，结构基本上正常；缺血再灌注损伤组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，胞浆溶解呈空泡或网状，细胞界限模糊，可见心肌细胞断裂；心先安预处理组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核呈椭圆形位于中央，细胞结构基本正常。
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2.2 p53的表达
正常对照组：心肌细胞内无棕黄色颗粒沉积，p53表达极弱或无表达；假手术组：心肌细胞内可见极少量的棕黄色颗粒，p53表达极弱；缺血再灌注损伤组：心肌细胞内有较多棕黄色颗粒，p53表达强；心先安预处理组：心肌细胞内无棕黄色颗粒沉积，p53表达极弱或无表达。图像分析结果显示，正常对照组 p53蛋白表达的平均光密度为1.357±0.051，假手术组 p53蛋白表达的平均光密度为1.295±0.068，缺血再灌注损伤组 p53蛋白表达的平均光密度为4.683±0.562；心先安预处理组p53蛋白表达的表达的平均光密度为1.309±0.03；正常对照组 p53蛋白表达的阳性面积率为0.192±0.028，假手术组 p53蛋白表达的阳性面积率为0.173±0.027，缺血再灌注损伤组 p53蛋白表达的阳性面积率为0.482±0.157；心先安预处理组p53蛋白表达的表达的阳性面积率为0.187±0.024。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义(P＜0.05)。经q检验，正常对照组、心先安预处理组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间p53蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；正常对照组与假手术组之间、心先安预处理组与假手术组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。见表1。
表1 心先安注射液预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤后各组p53蛋白表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注：* 正常对照组、假手术组、心先安预处理组与缺血再灌注损伤组比较，P＜0.001；# 心先安预处理组、假手术组与正常对照组比较，P＞0.05。
3 讨论
随着人口老龄化和缺血性心脏疾患的高发，如何保证缺血性心脏病患者以及有潜在缺血性心脏病风险的患者的围术期安全，降低恶性心血管事件的发生，提高麻醉安全，已成为临床医生关心的焦点。
合并心血管疾病的手术病人,围术期发生缺血再灌注损伤的机率较高,可能与多种因素有关,总的来说有3点:即能量代谢失常、氧自由基生成和钙超载。缺血再灌注损伤发生（MIR）后, 返回的氧产生大量氧自由基(OFP),可损伤心肌细胞膜，改变膜通透性、离子泵和离子通道, 增加Ca2+ 内流,使局部心肌细胞的心电不稳定性增加。心肌缺血时,除OFP聚集增多外, 无氧代谢产物乳酸也大量堆积, 再灌注的冲刷作用使之逸出,直接损伤心肌细胞膜, Ca2+ 、Na+ 内流,使心肌细胞复极离散,导致心肌细胞的动作电位2相折返,易触发恶性心律失常［1］。研究表明,MIR时,细胞浆、细胞核Ca2+含量均显著升高, 且细胞核钙超载是其心肌细胞凋亡的主要促发因素［2］。因此,最大限度地减少损伤、保护再灌注心肌就是降低围术期恶性心血管事件发生的关键。
研究表明,MIR后可出现心肌顿抑现象, 即短时间的心肌缺血尚不足以造成心肌坏死, 但再灌注后恢复正常或接近正常供血后, 其机械功能障碍却需数小时、数天、数周才能完全恢复［3］。心肌顿抑可使ATP消耗明显减少。腺苷是ATP的分解产物, 其与心肌细胞膜上的腺苷受体结合, 通过兴奋型C蛋白中介, 激活细胞膜上的腺苷酸环化酶, 生成cAMP。cAM P作为第二信使, 使无活性的蛋白激酶激活,催化多种蛋白质发生磷酸化反应,引起靶细胞各种生理生化反应, 如扩张冠脉, 抑制内皮素释放, 升高心肌细胞锰超氧化物歧化酶(Mn2SOD)含量,抗氧化,降低心肌细胞Na+ 、Ca2+含量等, 从而发挥心肌保护作用［4］。
心先安（MAC）是cAMP的衍生物。本实验发现, 增加外源性cAMP, 既有助于维持心肌氧耗平衡，又可发挥cAMP的心肌保护作用, 对抗再灌注对Ca2+内流等所致的心肌细胞膜损伤, 改善其电生理功能, 使恢复生理功能的心肌细胞与邻近的正常心肌细胞复极不一致性减少, 再灌注后心肌Q T离散度明显下降, 提示可以降
低恶性心律失常的发生［5］。
研究发现心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡有着密切的关系。而细胞凋亡与心肌受损程度以及受损心肌的重塑有直接的因果关系。细胞凋亡(apoptosis)是细胞死亡形式之一,是有核细胞在一定条件下启动其自身内部机制,通过内源性DNA内切酶的激活而发生自然死亡的过程。细胞凋亡的一个显著特征即受基因调控,心肌缺血/ 再灌注损伤时细胞凋亡也同样受基因调控。近年来人们发现p53与细胞凋亡有密切关系。正常的p53基因即野生型p53 基因(wt2p53)与突变型p53 基因(mt-p53) 均参与细胞凋亡的调节。野生型p53基因能诱导白细胞的凋亡,突变型p53则抑制细胞凋亡。齐丽彤等［6］应用Wistar大鼠结扎左冠状动脉45min再灌注4h ,观察到缺血-再灌注过程中心肌细胞p53 表达增加。Kirshenbaum 等研究心肌细胞凋亡的分子调节机制,结果证实p53基因为心肌细胞凋亡的激活因子,并且指导促凋亡基因Bax 的转录。
我们的实验结果显示,正常对照组、假手术组及心先安治疗组的p53表达极弱或阴性表达,缺血再灌注损伤组p53表达呈强阳性，证明p53基因过度表达能促进心肌细胞凋亡。本研究中, p53在缺血再灌注损伤组表达增加,因此可以认为p53的过度表达是心肌细胞凋亡的机制之一。而心先安预处理组p53表达极弱或阴性表达,说明心先安注射液具?明显改善心肌氧供和预防缺血再灌注心肌细胞损伤的作用,与改善微循环、减少钙超载、抗氧化自由基损伤有关。缺血再灌注损伤的机制很复杂，尚未完全阐明，已证实与多个因素相关，如氧自由基、钙离子超载、细胞因子的释放等等。通过对这些因素的干预，必定可以减轻缺血再灌注心肌的损伤，降低恶性心血管事件的发生。
从以上的实验结果和讨论来分析心先安注射液的应用为防治缺血再灌注损伤具有积极意义,并为加强缺血后心肌保护作用提供重要的理论依据。对合并缺血性心血管疾患或有潜在风险的手术病人，早期合理应用心先安，可降低围术期恶性心血管事件的发生，并对发生了缺血再灌注损伤的心肌细胞具有保护作用，减少心肌细胞的凋亡，降低缺血后心肌的重塑，具有重要的积极作用。
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