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作者：王庭欣 王庭祥 吴广臣 刘峥颢 夏立娅
【摘要】 目的研究黄芪多糖对小鼠免疫功能的影响。方法采用ConA诱导小鼠淋巴细胞转化试验及迟发性变态反应试验测试黄芪多糖(Astragalus Polysaccharide APS)对小鼠细胞免疫功能的影响；采用抗体生成细胞检测及半数溶血值实验测试黄芪多糖对小鼠体液免疫的影响；采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验测试黄芪多糖对小鼠非特异性免疫的影响。结果黄芪多糖能明显提高小鼠的足跖肿胀度、脾脏生成抗体细胞数、半数溶血值及巨噬细胞吞噬功能，黄芪多糖对小鼠淋巴细胞增殖能力无明显影响。结论黄芪多糖对正常小鼠的细胞免疫、体液免疫及巨噬细胞功能均有明显的增强作用。
【关键词】 黄芪；小鼠；多糖；免疫
Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of astragalus polysaccharide (APS) on immunological function in mice.MethodsBy lymphocyte transformation test and delayed type hypersensitivity (DTH), the effect of APS on celluar immunity was evaluated. By determining plaque forming cells (PFC) and HC50, the effect of APS on humoral immunity was studied. Abdomen macrophages of mice devour chicken red cell was used to asscess phagositosis of peritoneal macrophages.ResultsCompared with the normal control group, APS could promote DTH, PFC, HC50 and phagositosis of peritoneal macrophages,but had no effect on lymphocyte proliferation.ConclusionAPS can stimulate the immunological function in mice in different ways.
Key words：Astragalus; Mice; Polysaccharide; Immunity
黄芪属豆科多年生草本植物，其主要含有多糖、谷甾醇、棕榈酸、胆碱、黄酮类等营养素，能镇静中枢神经系统，清除体内脂质过氧化物，具有较强的抗氧化作用［1，2］。论文学术科研网本实验研究黄芪多糖对正常小鼠的免疫功能的影响，旨在探讨黄芪多糖对机体的免疫调节作用。
1 材料
1.1 试药
黄芪多糖本实验室自制，含量为60.2%，溶剂为蒸馏水。
1.2 动物
由河北医科大学实验动物学部提供，清洁级昆明种雌性小鼠（医动字第04056号）,18～22 g，144只，随机分为4组，每组36只，分别为溶剂对照组（只给蒸馏水）和黄芪多糖低、中、高（1.0，2.0，3.0 mg/kg.bw）3个剂量组，连续灌胃小鼠15 d。采用河北医科大学实验动物学部提供的全价饲料饲养。
1.3 试剂
MTT［3-(4,5-Dimethyl-thiazo1-2yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide］、PRMI-1640培养粉、刀豆蛋白A(ConA)为Sigma公司产品。
2 方法
2.1 迟发性变态反应(DTH)（足跖增厚法）
小鼠腹腔注射2%(V/V)羊红细胞SRBC 0.2 ml，致敏后4 d，测量左后足跖厚度，然后在测量部位皮下注射20 μl 20%SRBC，注射后于24 h测量左后足跖部厚度，同一部位测量3次，取平均值。以攻击前后足跖厚度的差值 (足距肿胀度)来表示DTH的程度。
2.2 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验
无菌取脾，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，然后将细胞悬浮于2 ml的完全培养液中，调整细胞浓度为2×106个/ml。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 ml，一孔加50 μl ConA (相当于5 μg/ml)，另一孔作为对照，置5%CO2 37℃培养72 h。培 培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 ml，加入0.7 ml不加小牛血清的RPMIl6A0细胞培养液，同时加入MTT(5 mg/ml)50 μl/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 ml盐酸异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个标本分装3孔作为平行样，在酶联免疫检测仪上比色测定，波长570 nm。
2.3 脾脏抗体生成细胞检测
每只鼠经腹腔注射2%SRBC 0.2 ml免疫5 d后，取脾，制成细胞悬液。将表层培养基加热溶解后，与等量双倍Hanks液混合，分装小试管，每管0.5 ml，再向管内加50 μl 10%SRBC、10 μl脾细胞悬液，混匀倾倒于琼脂糖玻片上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5 h，然后加补体，继续温育1.5 h，计数溶血空斑数。
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2.4 半数溶血值 (HC50)的测定
每只鼠经腹腔注射2%(V/V)SRBC 0.2 ml免疫5 d后，取血，制备血清，用SA缓冲液将血清200倍。取1ml加入10%SRBC 0.5 ml，补体1 ml。另设不加血清的对照管 。置37℃水浴中保温30 min，冰浴终止反应。2 000 r/min离心10 min。取上清1 ml，都氏试剂3 ml于试管内。同时取10%SRBC 0.25 ml，加都氏试剂至4 ml，于另一试管内充分混匀，放置1 min。于540 nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值，按下式计算HC50。
HC50=(黄芪多糖光密度值÷SRBC半数溶血时的光密度值)×稀释倍数
2.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验
每鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1 ml，30 min后处死动物，腹腔注射生理盐水2 ml，充分混匀,吸腹腔洗液1 ml，平均分滴于2张载玻片上，置37℃温育30 min。用生理盐水漂洗，晾干，固定， Giemsa染色，镜检。
2.6 数据处理
采用t检验的统计方法进行数据处理。
3 结果
3.1 黄芪多糖对小鼠细胞免疫功能的影响
灌胃小鼠黄芪多糖15 d后，1.0，2.0，3.0 mg/（kg?bw) 3个剂量组的足跖肿胀度与对照组比较均有统计学差异，而各剂量组的淋巴细胞增殖力与对照组比较无显著差异。结果见表1。表1 黄芪多糖对小鼠细胞免疫功能的影响(略)
3.2 黄芪多糖对小鼠体液免疫功能的影响
灌胃小鼠黄芪多糖15 d后，1.0，2.0，3.0 mg/（kg?bw） 3个剂量组的溶血空斑数及3.0 mg/（kg?bw）剂量的半数溶血值与其对照组比较均有统计学差异。结果见表2。表2 黄芪多糖对小鼠体液免疫功能的影响(略)
3.3 黄芪多糖对小鼠巨噬细胞功能的影响
灌胃小鼠黄芪多糖15 d后，3.0 mg/（kg?bw）剂量组的吞噬率和吞噬指数与其对照组比较均有显著性差异。结果见表3。表3 黄芪多糖对小鼠巨噬细胞功能的影响(略)
4 讨论
多糖类化合物作为免疫调节剂能激活淋巴细胞、巨嗜细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞；还能激活补体,促进细胞因子生成等在多途径对免疫系统发挥调节作用［3］。本实验从机体的细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞功能等方面研究了黄芪多糖对机体免疫功能的影响。
迟发性变态反应反映了机体的特异性细胞免疫功能，当T淋巴细胞受抗原刺激后，分化为特异性的致敏淋巴细胞，相同抗原再次侵入时，引起局部致敏淋巴细胞释放出多种淋巴因子，导致以单核细胞浸润为主的炎症反应，炎症反应的程度反映了机体对该抗原特异性细胞免疫力的大小［4］。灌胃小鼠黄芪多糖15 d后，1.0，2.0，3.0 mg/(kg?bw)3个剂量组的足跖肿胀度与对照组比较均有统计学差异，而各剂量组的淋巴细胞增殖力与对照组比较无显著差异。说明黄芪多糖能显著增加小鼠足跖肿胀程度。而在ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验中，黄芪多糖对小鼠的淋巴细胞转化力无明显影响。
抗体生成细胞检测是体外检查和计数产生IgM等Ig抗体生成细胞的一种方法，可作为判断机体体液免疫功能的指标。灌胃小鼠黄芪多糖15 d后，黄芪多糖在1.0～3.0 mg/(kg?bw)范围内均能提高抗体生成细胞数；在3.0 mg/(kg?bw)剂量下，能增加小鼠的半数溶血值。
巨噬细胞是一种非特异性免疫细胞，它能吞噬和消灭外来异物和自身死亡细胞。灌胃小鼠黄芪多糖15 d后，3.0 mg/(kg?b
w)剂量组的吞噬率和吞噬指数与其对照组比较均有显著性差异。由此表明黄芪多糖能明显提高巨噬细胞吞噬鸡细胞的吞噬率和吞噬指数。
本实验结果提示，APS与其它多糖一样可促进正常小鼠的细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞功能，具有免疫增强作用。
【参考文献】
［1］杨五彪，陈群力，马灵筠，等.黄芪多糖对兔动脉粥样硬化血管内皮细胞功能的影响［J］.陕西医学杂志，2005，26( 8):914.
［2］郝艳红，李庆章，魏平.黄芪多糖和香菇提取物对鸡内体内LPO含量的影响［J］.东北农业大学学报，1998，29(2):140.
［3］张秀军,徐俭,林志彬.羧甲基茯苓多糖对小鼠免疫功能的影响［J］.中国药学杂志，2002，37（12）：913.
［4］H.e.Xu.An Assessment of the toxicity and Hazards of pollutants in china［M］.The peking Union Medical Cllege and Beijing Medical University Press,1994:131.