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作者：刘颖 冯年平 许洁 巫珊 张欣
【摘要】 目的研究蟾毒灵的大鼠在体肠吸收机制。方法采用大鼠在体肠单向灌流吸收实验模型，并应用重量法校正灌流液体积，考察吸收部位、药物浓度、pH值及P-糖蛋白(P-gp)抑制剂对药物吸收的影响。结果蟾毒灵的吸收速率常数（Ka）和表观吸收系数（Papp）分别按照空肠、回肠、十二指肠、结肠的顺序下降。2～20 μg ? ml-1的药物浓度对Ka和Papp无显著影响（P＞0.05）；灌流液pH值对药物吸收有影响；含P-gp抑制剂组与不含P-gp抑制剂组相比，Ka和Papp无显著性差异（P＞0.05）。结论蟾毒灵为全肠段吸收，吸收机制为被动扩散，且P-gp对药物的小肠吸收基本无影响。论文学术科研网
【关键词】 蟾毒灵； 肠吸收； 单向灌流
Abstract：ObjectiveTo evaluate bufalin in situ intestinal absorption mechanism. MethodsThe rat single-pass intestinal perfusion technique was applied, and the gravimetry was used to correct the perfusion volume. The concentration of bufalin was determined by HPLC. The effects of absorption site, drug concentration, pH value and P-glycoprotein (P-gp) inhibitor on bufalin absorption were studied. ResultsThe order of the drug absorption constant(Ka) and apparent absorption coefficient(Papp) was as follows：jejunum＞ileum＞duodenum＞colon. Drug concentration had little effect on Ka and Papp (P＞0.05).pH value of the drug solution affected drug absorption. There was no significance in Ka and Papp between presence of P-gp inhibitor and no P-gp inhibitor（P＞0.05）. ConclusionBufalin can be absorbed at all intestinal segments. The absorption of bufalin is a passive diffusion process and not affected by P-gp.
Key words：Bufalin; Intestinal absorption; Single-pass intestinal perfusion
蟾毒灵是名贵中药蟾酥Venenum Bufonis中的一种有效成分。蟾毒灵具有较强的抗肿瘤作用，作用机制涉及诱导细胞凋亡、分化、抑制肿瘤的血管生成等［1～3］。近些年，有学者对蟾毒灵脂质体、透皮给药制剂等方面进行研究报道［4，5］，但有关其在体肠吸收的研究未见报道。研究药物体内吸收部位和机制是药物制剂处方前研究的重要内容，为剂型的设计提供生物药剂学依据。本实验采用大鼠在体肠段原位单向灌流法考察蟾毒灵的吸收部位及探讨吸收机制，为蟾毒灵的制剂研究提供理论依据。
1 器材
1.1 试药蟾毒灵原料（江西本草天工科技有限公司）；蟾毒灵对照品（sigma公司）；盐酸维拉帕米标准品（中国生物制品检定所）。空白灌流液（Krebs-Ringer""""s营养液，自配，每1 000 ml含NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖 1.4 g）；甲醇（色谱纯，上海安谱科学仪器有限公司）；其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器 HL-2B数显恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；红外灯（上海安大照明电器有限公司）；Angilent1200series高效液相色谱仪； Agilent G1314A紫外检测器；Agilent 8453紫外-可见分光光度计；BP210S电子天平（德国Sartorius）；PHS-3S型pH计（上海精密科学 学仪器有限公司）；DKB-501A型超级恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）。
1.3 动物 SD大鼠，清洁级，雄性（200±20）g，上海中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(沪)2003-0002。
2 方法与结果
2.1 HPLC分析方法的建立
2.1.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm, column No：99903）；流动相为甲醇∶水（70∶30）；流速 1.0 ml ? min-1；柱温30℃；检测波长 300 nm；进样量20 μl。
2.1.2 方法学验证 用Krebs-Ringer""""s营养液分别配制蟾毒灵溶液、维拉帕米溶液。分别取上述两种溶液及空白Krebs-Ringer""""s营养液进样，在“2.1.1”项下色谱条件下测定，色谱图如图1～3所示。空白Krebs-Ringer""""s营养液及维拉帕米在此条件下对蟾毒灵的测定均无干扰。精密称取蟾毒灵对照品适量,用空白Krebs-Ringer""""s营养液配制0.2，1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μg ? ml-1的蟾毒灵溶液，进样，测定。以蟾毒灵峰面积（A）对浓度（C）作线性回归，得蟾毒灵的标准曲线方程为：A=13.107C-0.476 6，r=0.999 5(n=3)。线性范围0.2～20 μg ? ml-1。高、中、低3种浓度的回收率为98.2%～101.1%（n=5）,日内、日间精密度RSD均小于2%（n=5）。
图1 空白Krebs-Ringer""""s营养液HPLC图（略）
2.2 蟾毒灵在肠灌流液中的稳定性考察 用空白Krebs-Ringer""""s营养液分别配制高（20 μg ? ml-1）、中(10 μg ? ml-1) 、低(2 μg ? ml-1）浓度的蟾毒灵溶液作为供试液，置于37℃恒温水浴中，分别于0，30，60，90，120 min取样，按“2.1.1”项下色谱条件测定，并计算浓度。在120 min内蟾毒灵于肠灌流液中的含量无明显变化，RSD＜1%，表明其基本稳定。
图2 蟾毒灵加空白Krebs-Ringer""""s营养液HPLC图（略）
图3 维拉帕米加空白Krebs-Ringer""""s营养液HPLC图（略）
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2.3 大鼠在体肠吸收
2.3.1 实验方法 取实验前禁食12 h（自由饮水）的大鼠，腹腔注射25%乌拉坦溶液（1.0 g ? kg-1）麻醉，固定后沿腹中线打开腹腔约3 cm，选取考察部位后于其两端切口（肠段约10 cm），插管，结扎。用37℃的生理盐水冲洗肠道至净，用空气排净生理盐水。伤口处用生理盐水润湿的纱布覆盖保湿,红外灯下保温。进口处用已知重量的装有供试液的小瓶中灌流，同时出口处放另一已知重量的小瓶收集。灌流速度控制在0.2 ml ? min-1。每隔15 min迅速更换下一组供试液小瓶和收集液小瓶，灌流共持续105 min。冷至室温后称重。实验结束处死大鼠后迅速剪下被考察的肠段，测量长度和内径。采用重量法计算药物的吸收速率常数（Ka）和表观吸收系数(Papp)［6］，计算公式如下：
Ka=（1-CoutCin×QoutQin）×Vπr2l
Papp=-v×ln（CoutCin×QoutQin）2πrl
式中：Cin，Cout分别为灌流进出口的药物浓度；Qin ，Qout 分别为肠道进出口灌流液的体积；v灌流液流速；r和l分别为灌流肠段的内径和长度。
2.3.2 影响蟾毒灵肠吸收因素的考察
2.3.2.1 吸收部位对药物吸收的影响 考察的吸收部位分别为十二指肠、空肠、回肠和结肠。十二指肠段为自幽门下1 cm处开始；空肠段为自幽门15 cm处开始；回肠段为自盲肠上行20 cm处开始；结肠段为从盲肠后端开始。采用“2.3.1”项下方法，用空白Krebs-Ringer""""s营养液配制5 μg ? ml-1的蟾毒灵溶液作为供试液，分别进行各个肠段的吸收实验。结果见表1。经SPSS软件进行ANOVA分析，各肠段的Ka及Pout的差异是否有统计学意义。对于 Ka,空肠和回肠间无显著性差异（P＞0.05），其余肠段两两间均有显著性差异（P＜0.05）；对于Papp，空肠和回肠间无显著性差异（P＞0.05），十二指肠和结肠间也无显著性差异（P＞0.05）。Ka和Papp分别按照空肠、回肠、十二指肠、结肠的顺序下降 ，空肠和回肠的 较相近。蟾毒灵在小肠各段均有吸收，但不存在特异性的吸收部位。
2.3.2.2 药物浓度对药物吸收的影响 分别用浓度为1，5，15 μg ? ml-1的蟾毒灵供试液进行空肠段的灌流实验。结果见表2。经SPSS软件进行ANOVA分析，结果表明药物浓度在考察范围内对Ka和Papp无显著性影响（P＞0.05）,说明药物主要以被动扩散的形式被转运吸收。
表1 不同吸收部位对药物Ka和Papp的影响（略）
表2 不同药物浓度对药物Ｋa和Papp的影响（略）
2.3.2.3 灌流液pH值对药物吸收的影响 分别用pH值为5.4，6.8和7.8蟾毒灵供试液（5 μg ? ml-1）的进行空肠段的灌流实验。结果见表3。经ANOVA分析，蟾毒灵在pH7.8的灌流液中的Ｋa和Papp均与pH5.4和pH6.8有显著性差异（P＜0.05），pH5.4和pH6.8间无显著性差异（P＞0.05）。
表3 不同灌流液pH值对药物Ｋa和Papp的影响（略）
2.3.2.4 P-糖蛋白(P-gp)对药物肠吸收的影响 P-gp是肠细胞上的转运蛋白（也称为“药物溢出泵”）。它通过将其底物药物从肠上皮细胞转运回至肠腔而影响药物吸收。以盐酸维拉帕米作为P-gp抑制剂，分别用含0，0.1，0.5 mmol ? L-1维拉帕米的蟾毒灵供试液（5 μg ? ml-1），在远端回肠段进行灌流实验［7］。对于含有维拉帕米组的供试液组，灌流前用含有相同浓度的维拉帕米的空白灌流液平衡孵育待灌流肠段30 min(见表4）。经ANOVA分析，含维拉帕米组与不含维拉帕米组的Ｋa和Papp无显著性差异（P＞0.05），表明P-gp对蟾毒灵基本无肠道外排作用，对其小肠吸收无显著影响。
表4 维拉帕米浓度对药物Ｋa和Papp的影响（略）
3 讨论
在常用的研究药物肠吸收在体、体内、离体3种模型中，在体模型是最常用方法。在体肠灌流方式有振动灌流、循环灌流和单向灌流。单向灌流的灌流速度较慢（0.2 ml ? min-1），较接近体内肠道的环境，与相对长时间（4～6 h）高速回流循环液的循环灌流相比，对肠壁粘膜的损伤小。由于蟾毒灵在肠灌流液中的溶解度较低（小于40 μg ? ml-1），适合采用单向灌流。聂淑芳等［6］人对重量法和酚红法在单向灌流技术中的应用进行了评价，结果表明重量法更适合灌流液体积的校正，能显著减少实验误差。因此，本实验采用在体大鼠单向灌流法研究蟾毒灵的肠吸收特性，并采用重量法校正灌流液体积。
在大鼠在体单向灌流试验中除了灌流液体积的矫正外，肠壁及管道对药物吸附作用也是影响测定结果准确性的因素.将肠壁及管道分别置于37℃灌流供试液中，通过测定在120 min内孵育后与孵育前的药液含量比值来反映吸附程度，结果均大于98%，所以可以认为肠壁和管道对药物基本无吸附作用。
根据本实验结果可推断蟾毒灵的口服吸收是一个被动转运的过程，且不受P-gp外排蛋白的影响。因此在剂型设计上可以采用增加蟾毒灵的溶解度和制剂的溶出度来提高其生物利用度。
【参考文献】
［1］ Numazawa S, Inoue N, Nakura H, et al. A cardiotonic steroid bufalin-induced differentiation of THP-1 cells. Involvement of Na+, K+-ATPase inhibition in the early changes in proto-oncogene expression［J］.Biochem Pharmacol, 1996, 52(2): 321.
［2］ 赵建斌，崔 勤，王文亮. 蟾毒灵诱导人急性早幼粒细胞性白血病细胞凋亡的实验观察［J］.解放军药学学报, 2004, 20(3):161.
［3］ Lee DY,Yasuda M, Yamamoto T, et al. Bufalin inhibits endothelial cell proliferation and angiogenesis in vitro［J］.Life Sci. 1997, 60(2): 127.
［4］ 罗会俊，潘铁英，史新梅，等. 蟾毒灵对脂质体双分子层结构的影响: 31P NMR研究. 波谱学杂志, 2000, 17（5）: 395.
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［6］ 聂淑芳, 潘卫三, 杨星钢, 等. 对大鼠在体肠单向灌流技术中重量法的评价［J］.中国新药杂志, 2005, 14(10):1176.
［7］ 张海燕, 平其能. 药物转运蛋白对灯盏花素小肠吸收的影响［J］.中国药科大学学报, 2O07, 38(1)：60