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作者：谢红林 王陪 李皓岩 薛景凤
【摘要】 目的观察中药天年饮对衰老大鼠卵巢抗氧化能力和端粒酶活性的作用。方法D-半乳糖连续腹腔注射建立亚急性衰老的大鼠模型，并给予天年饮灌胃。分别采用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法、PCR-ELISA法检测卵巢组织SOD活性、MDA含量和端粒酶活性。结果天年饮可明显提高衰老大鼠卵巢组织SOD和端粒酶活性，降低MDA含量，天年饮用药组与衰老模型组比较差异显著（P＜0.01或P＜0.05）。结论中药天年饮可提高衰老大鼠卵巢抗氧化能力和端粒酶活性，具有延缓卵巢细胞衰老的作用。论文学术科研网
【关键词】 天年饮 衰老 端粒酶 抗氧化 卵巢
1988年Meites［1］提出，在衰老的过程中，神经-免疫-内分泌网络起着重要作用，而下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）是其重要组成部分，研究HPG轴的衰老机制以及药物对其调节作用已成为目前抗衰老研究的热点。女性产生更年期症状的主要原因是卵巢功能减退，伴随生殖腺衰老所发生的性激素分泌及调节机制的改变不仅导致生殖功能的减退，同时也与衰老的各种表现有关［2］。端粒酶是肿瘤研究领域的热点，近年的研究表明，几乎所有的人肿瘤细胞中可检测到端粒酶活性，端粒酶的活性与癌的发生发展密切相关［3］。目前，在衰老及延缓衰老的研究中，端粒及端粒酶也逐渐受到重视。天年饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成，能填精补髓、乌发延年。本课题组的研究已经发现，中药天年饮可提高衰老大鼠的免疫功能、延缓雄性大鼠性腺衰老［4，5］，本文观察了天年饮对衰老雌性大鼠卵巢SOD活性、端粒酶活性及MDA含量的影响，以期为进一步研究中药延缓卵巢功能衰退开辟另一途径。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 雌性SD大鼠，体重180～250 g。将大鼠随机分为4组，正常组、衰老模型组、天年饮用药组和阴性对照组，每组16只。其中模型组、用药组、阴性对照组大鼠均采用D-半乳糖连续腹腔注射（按200 mg/kg给药，1次/d，连续40 d）制作亚急性衰老的动物模型。模型组大鼠造模成功后不再做任何处理；用药组大鼠造模成功后每天用天年饮灌胃，共30 d；阴性对照组大鼠在造模成功后每天灌胃生理盐水，量及灌胃时间同用药组大鼠。
1.2 药品与试剂 天年饮由炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓等6味中药组成，熬制后每毫升含生药1.5 g，按16.2 g/kg灌胃给药。D-半乳糖(D-gal)，北京化学试剂公司(批号020402)；端粒酶活性检测试剂盒，德国Roche公司；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）检测试剂盒，南京建成生物工程研究所。
1.3 端粒酶活性的检测
1.3.1 标本制备各组分别随机选取8只大鼠，断头处死，迅速取出双侧卵巢称重，生理盐水漂洗后，4℃，10 000 r/min离心1 min，弃上清液；将沉淀组织液氮冷冻后研磨，加入洗液洗涤，同上条件离心1 min；沉淀加入裂解液悬浮，冰浴30 min，4℃，13 000 r/min离心20 min，取上清液-70℃冰箱保存。
1.3.2 检测端粒酶活性采用德国Roche公司的端粒酶活性检测试剂盒（Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS）,按试剂盒说明进行操作，包括端粒扩增、杂交及ELISA检测，分别于检测波长450 nm和参考波长690 nm处检测吸光度，并根据下面公式计算结果：
RTA=(AS-ASO)AS,IS(ATS8-ATS8,O)/ATS8,IS×100
1.4 卵巢组织SOD活性、MDA含量的测定取各组余下的8只大鼠，断头处死，迅速取双侧卵巢，称重后加入生理盐水冰浴下匀浆，4℃、10 000 0 r/min离心10 min，取上清液-70℃冰箱保存。分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法按试剂盒说明进行操作，检测卵巢组织中的SOD活性和MDA含量。
1.5 统计处理 采用SPSS11.0统计软件，以方差分析进行统计处理。
2 结果
2.1 端粒酶活性 各组大鼠卵巢端粒酶活性见表1。衰老模型大鼠卵巢端粒酶活性明显低于正常大鼠（P＜0.01）；天年饮可抑制衰老大鼠卵巢端粒酶活性的降低，天年饮用药组大鼠端粒酶活性明显高于衰老模型组大鼠（P＜0.01）。
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表1 各组大鼠卵巢端粒酶活性（略）
与模型组比较，*P＜0.01；与天年饮用药组比较，#P＜0.01；n=8
2.2 SOD活性和MD
DA含量 各组大鼠卵巢组织SOD活性和MDA含量见表2。
与正常大鼠比较，衰老模型大鼠卵巢SOD活性明显降低、MDA含量明显升高；中药天年饮可提高衰老大鼠卵巢SOD活性、降低MDA含量。
表2 各组大鼠卵巢组织SOD活性和MDA含量（略）
与正常组比较，*P＜0.01；与衰老模型组比较，#P＜0.01，##P＜0.05；n=8
3 讨论
绝经期妇女产生更年期症状的主要原因是卵巢功能减退，失去排卵及分泌雌激素、孕激素的功能。卵巢分泌激素减少，导致围绝经期中老年妇女的内分泌、免疫功能、骨代谢、自由基代谢等的显著改变，出现骨折、感染、癌症和自身免疫性疾病的几率增高以及老年痴呆症发病率增加（女性发病率为男性的3～4倍）等临床特征，对中老年妇女的健康造成了很大影响。机体在代谢中消耗的氧，2%～5%变成活性氧，如超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等，而线粒体是产生活性氧的主要场所。在正常生理情况下，体内存在清除自由基的防御系统，包括SOD、谷胱甘肽过氧化物酶等，还有一些抗氧化物质VE，VC等。由于这些酶类及抗氧化物质的存在，使体内的活性氧处于生成与消除的平衡状态，不会对机体造成损伤。随着年龄的增长，这些抗氧化防御体系活性降低，清除自由基能力下降，使体内活性氧生成过量；过量的活性氧可以攻击位于线粒体内膜上的脂类、蛋白质和mtDNA，影响线粒体的功能，导致细胞受损、衰老和疾病的发生［6］。
端粒（Telomere）是真核细胞染色体末端一段特殊的DNA-蛋白质复合体，在维护染色体的完整性，防止染色体自身及染色体之间的融合、DNA降解、染色体缺失及抵御细胞内各种蛋白酶对染色体末端的异常操作有重要作用，并参与染色体在细胞核内的定位及基因表达调控［7］。端粒的长短和稳定性决定了细胞的寿命，并与衰老和癌变密切相关。影响端粒长度的因素很多，其中端粒酶是重要的延长端粒的因素，它可通过逆转录的方式合成染色体末端DNA的重复序列，从而维持端粒长度的稳定，阻止细胞凋亡甚至导致肿瘤的发生［8］。研究表明，活性氧不但与细胞的增殖分化有关，它还可以通过基因表达和转录控制端粒酶，使端粒酶的活性降低［9］；反之，端粒酶也可对抗氧化应激反应［10］，二者在衰老过程中均发挥着重要作用。
天年饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成。何首乌丸本由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝组成，能填精补髓、乌发延年；于此基础上加淫羊藿补肾壮阳以强筋骨，丹参活血化瘀以通心脉，茯苓健脾利湿以宁心神。诸药相配通调心脾肝肾四脏，而以肾为主。气机条达，血脉流通，衰从何由。本研究观察发现，中药天年饮可明显提高衰老雌性大鼠卵巢端粒酶和SOD活性、降低MDA含量，说明天年饮可提高衰老雌性大鼠卵巢的抗氧化能力及端粒酶活性，通过延缓端粒的缩短以及降低活性氧含量，促进细胞的增殖和分化，从而达到延缓卵巢细胞衰老的作用。
【参考文献】
［1］ Meites J. Neuroendocrine biomarkers of aging in the rat［J］.Exp Gerontol, 1988, 23(4～5)：349.
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［10］ Passos JF, Saretzki G, von Zglinicki T. DNA damage in telomeres and mitochondria during cellular senescence: is there a connection ［J］.Nucleic Acids Res 2007,35(22)：7505.