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【摘要】 目的研究瓜馥木的化学成分，寻找抗肿瘤的活性成分。方法采用硅胶柱色谱技术进行分离纯化，运用波谱法进行结构解析，并进行体外抗肿瘤活性筛选。结果从瓜馥木根的乙醇提取物中分离得到1个化合物，经理化常数和波谱 (EI2MS，1H2NMR，13C2NMR) 分析，鉴定为马兜铃内酰胺AⅡ，化合物马兜铃内酰胺AⅡ对肺腺癌GLC282、白血病细胞株HL60的细胞株的IC50分别为：234.35，101.17 μmol?L-1。结论马兜铃内酰胺AⅡ生物碱化合物具有一定的抗肿瘤活性。
【关键词】 瓜馥木 化学成分 分离和提纯 马兜铃内酰胺AⅡ 抗肿瘤活性
瓜馥木Fissistigma oldhamii（Hemsl.）Merr.为番荔枝科（Annonaceae）瓜馥木属(Fissistigma)植物，根入药，性温味辛，具有祛风除湿、镇痛消肿、活血化淤等功效，主要用于跌打损伤、关节炎及坐骨神经痛的治疗［1］。论文论文参考网为寻找反映瓜馥木中抗炎、镇痛活性特征成分，我们对瓜馥木化学成分进行了系统研究，已报道O-甲基芒籽碱(O-methyl-moschtaoline)、酸花木碱(毛叶含笑碱，oxylopine)、氧代克斑宁(7-oxocrebanine)和胡萝卜苷(daucosterol)等成分的研究［2］。本文报道另一个化合物的分离和结构鉴定，并探讨该化合物对肺腺癌GLC-82及HL60白血病细胞株的抗肿瘤活性。
1 仪器与材料
显微熔点测定仪(温度计未校正)；AB-HS型质谱仪； DRX-400型超导核磁共振仪，TMS为内标。3164 型二氧化碳培养箱(美国FORMA 公司)；比色采用Thermo Labsystems Multiskan MK3 全自动酶标仪。
药材采于江西，由江西中医学院赖学文副教授鉴定为瓜馥木Fissistigma oldhamii（Hemsl.）Merr.，标本存于广东医学院药学教研室。
2 方法与结果
2.1 提取与分离瓜馥木根药材经粉碎后用乙醇加热回流提取（3 h×3次），合并滤液，减压浓缩得总浸膏590 g。浸膏用5%HCl捏溶处理后其酸不溶性部分用蒸馏水洗至中性，用水分散均匀，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯进行提取，回收溶剂得石油醚部分33.2 g，氯仿部分63 g，醋酸乙酯部分45.4 g。氯仿部分反复进行硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇为洗脱剂，得马兜铃内酰胺 AⅡ化合物 (15 mg)。
2.2 结构鉴定采用化学和光谱的方法进行结构鉴定。该化合物与生物碱试剂反应呈阳性，推测该化合物为生物碱。EI-MS给出分子离子m/z 265(M+,100)，结合1H-NMR、13C-NMR，推断分子式为C16H11NO3。UV λMeOHmaxnm:230,265,277； IRKBrmax cm-1：3450，3251（羟基，NH），1691，1656(羰基)，1614，1502 (苯环)；EI-MS谱：265(M+,100)，250(M+-CH3,51)，222(M+- CH3-CO,18)，UV，IR，EI-MS的特征显示该化合物属于马兜铃内酰胺类成分［3］。1H-NMR显示在δ4.04 (3H,s)为一甲氧基信号；δ7.08～9.26 ppm处有6个芳香质子信号，其中δ9.26（1H,m），7.49（2H,m），7.77（1H,m）显示出未取代的D环有4氢， H-5由于受3个环的去屏蔽作用，出现在最低场的δ9.26ppm处，可知δ7.49（2H,m）为H-6,H-7，δ7.77（1H,m）为H-8；δ7.08（1H,s）及7.68（1H,s）二个孤立芳香质子信号显示A、C环上各有一孤立芳香质子，因此，A环中有两个芳香质子被取代。13C-NMR显示在δ171.8 ppm处为内酰胺羰基信号,在δ 150.7～107.1有14个芳碳信号，DEPT显示有9个季碳、6个叔碳信号，δ57.4处为甲氧基。该化合物的UV，IR，1H-NMR，13C-NMR，EI-MS数据与文献［3，4］中的马兜铃内酰胺AⅡ（Aristolactam AⅡ）数据基本一致。因此，该化合物被鉴定为Aristolactam AII，结构式见图1。
图1 瓜馥木中各化合物结构式（略）
2.3 样品体外培养抗肿瘤作用实验
2.3.1 实验分组 实验分为①空白组：每孔仅为1640培养液，在测光密度值（OD值）时用于调“0”；②对照组：每孔为含1640培养液稀释的单细胞悬液；③实验组：又分1.00×103，1.00×102，10.00，1.00 0，0.10，1.00×10-2μmol?L-1马兜铃内酰胺AⅡ组，即每孔含1640培养液稀释的单细胞悬液和不同浓度马兜铃内酰胺AⅡ。精密称量马兜铃内酰胺AⅡ后用少量DMSO充分溶解，再用1640培养基稀释成不同浓度备用。各组每孔溶液总体积均为200.00 μl。
论文参考网
2.3.2 MTT法检测药物的抗肿瘤实验 取已贴壁的GLC-82细胞，用质量浓度为0.25%胰酶消化后，计数活细胞，用1640培养基稀释成5×104/ml的单细胞悬液备用；取对数生长期的悬浮HL60细胞用1640培养基稀释成1×105/ml的单细胞悬液备用。分别将两种单细胞接种到96孔培养板，每组设4个复孔，对照组每孔加单细胞悬液200.00 μl，不同浓度实验组每孔加单细胞悬液190.00 μl和不同浓度的马兜铃内酰胺AⅡ10.00 μl；对照组和不同浓度实验组细胞接种后置于37℃，100％相对湿度，含5％CO2和95%空气的培养箱中预培养48 h；然后取出，仔细地吸去上清液?于每孔中加入150.00 μl DMSO，轻轻振荡以使甲?H完全溶解；约1 h后于490 nm波长处用酶标仪测OD值。按抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%计算。采用SPSS 11.5统计软件包进行统计分析，各组间样本均数采用Dunnett-t检验。实验数据及分析结果见表1。并用Probit回归法［5］估算半数抑制浓度（IC50值），马兜铃内酰胺AⅡ对GLC-82，HL60细胞的IC50分别为234.35，101.17 μmol?L-1。
表1 马兜铃内酰胺AⅡ对GLC-82及HL60细胞抑制的影响（略）
与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；n=4
3 讨论
本研究用MTT法研究发现：从瓜馥木中分离得到的单体化合物马兜铃内酰胺AⅡ碱对GLC-82细胞和HL60细胞均表现出一定的肿瘤抑制作用，且抑制作用随药物浓度的增加而增强，作用强度与剂量呈一定的量效关系。
在低剂量1 μmol?L-1以下时，马兜铃内酰胺AⅡ对肺腺癌GLC-82细胞株的作用不明显(P>0.05)，但对于白血病HL60细胞株抑制作用在剂量0.10 μmol?L-1以上时作用明显（P<0.01）。通过回归计算的IC50分别为234.35，101.17 μmol?L-1，其作用效果不同，表明马兜铃内酰胺AⅡ对两种细胞株有一定的选择作用，作用机制尚须进一步研究。
从瓜馥木中分离得到的O-甲基芒籽碱、氧代克斑宁等化合物对肺腺癌GLC-82细胞株亦有抗癌活性且作用强度相似（IC50 分别为83.31，109.17 μmol?L-1）［5］，但马兜铃内酰胺AⅡ的IC50为234.35 μmol?L-1，其作用强度不同，可能与化合物的结构类型有关（见图1）。化合物O-甲基芒籽碱、氧代克斑宁为阿朴菲类型生物碱，马兜铃内酰胺AⅡ为马兜铃内酰胺类型生物碱，研究表明针对肺腺癌GLC-82细胞株，化合物的结构母核起主导作用，各取代基团对它的生物活性有一定的影响。初步构效关系研究表明，阿朴菲类型的生物碱对肺腺癌GLC-82细胞株的毒性作用稍强。
瓜馥木中生物碱为瓜馥木抗炎、镇痛作用主要有效成分［6］，MTT实验法表明瓜馥木中的生物碱亦具抗肿瘤活性作用，提示瓜馥木药材值得深入研究。
【参考文献】
［1］ 江苏新医学院. 中药大辞典,第22版［M］.上海：上海科学技术出版社，2007：758.
［2］ 彭新生，高幼衡，刁远明，等.瓜馥木的化学成分研究(Ⅱ)［J］.中草药,2006,37(7):984.
［3］ 余冬蕾，郭 剑，廖永红，等.柴玉盘中的新内酰胺［J］.植物学报,1999,41(10):1104.
［4］ Wen-Li Lo, Fang-Rong Chang ,Yang-Chang Wu. Alkaloids from the Leaves of Fissistigma glaucescens［J］.Jorunal of the Chinese Chemical Society，2000，47(6)：1251.
［5］ 彭新生，周艳芳.氧代克斑宁对人肿瘤细胞GLC-82、HL60增殖的影响［J］.中药药理与临床，2007，23(5)：71.
［6］ 彭新生，高幼衡，刁远明. 瓜馥木成分与药理研究进展［J］.江西中医学院学报，2004，16(5)：80