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作者：张郁青，张馥敏，张定国，周蕾，姚静，陈亦江，常在，高翔，李传富，哈团柱，马文珠，曹克将
【关键词】 红细胞生成素
Protective effect of recombinant human erythropoietin against acute myocardial infarction in rats
【Abstract】 AIM: To study the protective effects of recombinant human erythropoietin (rHuEPO) on heart function and infarct size in rats with acute myocardial infarction (AMI) and to explore the mechanism of the protective effect. METHODS: Sixteen Wistar rats were divided randomly into 2 groups: AMI group (n=8) and treatment group (n=8). AMI models were made by ligating the left anterior descending coronary artery(LAD). rhEPO was injected in treatment group (3000 IU/ kg, ip) once daily for 3 consecutive days (1 d before, at the start of, and 1 d after surgery) and 2 wk later (14-16 d after surgery). Transthoracic echocardiography was carried out 2 and 21 d after operation respectively. Then the rats were sacrificed. Infarct sizes were measured by TTC stain, vascular density and the expressions of Bcl2 and Bax examined by immunohistochemical technique. RESULTS: There was no significant difference in baseline LV functions between AMI group and treatment group 2 d after operation. LVEF and LVDs were significantly improved in treatment group than those in AMI group on 21 d after operation. Also,the smaller infracted size ［(26.0±0.9)% vs (28.1±1.5)%, P<0.05］, and higher capillary density［(10.4±1.5)/scope vs (6.3±0.7)/scope, P<0.05］ were confirmed in treatment group than those in AMI group on 21 d after operation. An upregulation of Bcl2 A value ［(0.116±0.005) vs (0.103±0.006), P<0.05］ and a downregulation of Bax A value ［ (0.125±0.010) vs （0.147±0.014）, P<0.05 ］ were found in treatment group as compared with those of AMI group. CONCLUSION: RHuEPO could improve rats heart function and reduce infarct size after myocardial infarction, which may be related with reducing apoptosis and stimulating angiogenesis.
【Keywords】 erythropoietin, recombinant; myocardial infarction; heart function n; Bcl2; Bax
【摘要】 目的:观察重组人红细胞生成素(rHuEPO)对心肌梗死大鼠心功能和心肌梗死面积的影响,并探讨其机制. 方法:16只Wistar大鼠随机分心肌梗死组和治疗组,结扎左冠前降支制备急性心肌梗死模型,治疗组围手术期连续3 d腹腔注射rHuEPO［3000 IU/(kg・d)］， 14 d后以相同剂量再连续注射3 d；术后2 d及3 wk二维超声心动图检查心功能；术后3 wk处死大鼠，TTC测定心肌梗死面积，免疫组化检测缺血区毛细血管密度、Bcl2和Bax的表达. 结果: 术后2 d两组之间心功能无明显差异，术后3 wk对照组左室射血分数（LVEF）和左室收缩末期内径（LVDs）改善程度明显劣于治疗组（P<0.05）. 与对照组相比，术后3 wk治疗组梗死面积明显减少［分别为(26.0±0.9)%，(28.1±1.5)%， P<0.05］、毛细血管密度显著增加［分别为(10.4±1.5)/视野，(6.3±0.7)/视野，P<0.05］，Bcl2蛋白表达增加（A值分别为0.116±0.005，0.103±0.007， P<0.05），而Bax表达减弱（A值分别为0.125±0.010，0.147±0.014，P<0.05）. 结论:rHuEPO能缩小大鼠心肌梗死面积，改善心肌梗死后心功能，其机制可能与减少缺血区心肌细胞凋亡以及促进缺血区毛细血管生成有关.
【关键词】 红细胞生成素,重组; 心肌梗死;心功能；Bcl2; Bax蛋白
0引言
随着生活水平的改善，冠心病的发病率逐年提高，并有发病低龄化的趋势，已经成为威胁我国人民生命健康的第一杀手. 急性心肌梗死后造成有功能的心肌细胞减少、心室重构,最终可导致心衰［1］. 临床观察到应用促红细胞生成素（erythropoietin， EPO）治疗贫血合并充血性心力衰竭患者,能提高患者心脏排血指数［2］. 在大鼠心室肌细胞培养液中,加入重组人红细胞生成素（rHuEPO）能增加细胞耐受缺氧的能力,其保护作用被rHuEPO抗体阻断［3］. 我们观察rHuEPO对大鼠急性心肌梗死后心功能及心肌梗死面积的影响，并探讨其机制.
1材料和方法
1.1动物分组与模型建立健康雄性Wistar大鼠16只,体质量(210±20)g (购自南京大学模式动物研究所),随机分为2组:急性心肌梗死(AMI)组8只、治疗(AMI+rHuEPO)组8只. 氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，颈部及前胸备皮，伏消毒；切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织，游离并切开气管，插入气管插管，连接呼吸机，进行机械通气（潮气量2 mL，呼吸频率60 次/min）；在左侧第3，4肋间开胸；结扎冠状动脉前降支（LAD）中上1/3交界，观察局部心肌变紫色、室壁膨出为心梗模型成功标志. 治疗组围手术期每天腹腔注射rHuEPO 3000 IU/kg，共3 d（即手术前1 d、手术当日、手术后1 d）,在术后14，15，16 d以同等剂量再连续注射3 d.
1.2术后超声心动图检测术后2 d及术后3 wk分别进行超声心动图检测左室舒张末期内径（LVDd）,左室收缩末期内径（LVDs）,左室射血分数（LVEF）.
1.3心肌梗死面积测定3 wk末处死大鼠,摘除心脏,4℃生理盐水冲洗,沿冠状沟切除心房,将心室置于-20℃冻存5 min,继将左心室从心尖至心底部等分切成5片，每片约1～2 mm,置于10 g/L的TTC溶液（pH＝7.4）中,37℃染色5～30 min,正常心肌为鲜红色,梗死心肌为白色,数码照相后用计算机图像分析技术测定心肌梗死面积.
1.4缺血区毛细血管密度定量检测以factor VIII免疫组化染色，采用NYD1000型软件系统在光镜（×100）下计算梗死周边区毛细血管数量，每张切片随机取5个视野，取5个视野的毛细血管数均数.
1.5检测缺血区心肌组织Bcl2和Bax蛋白水平按Bcl2和Bax免疫组化试剂盒说明书进行操作. 心肌细胞经免疫组织化学染色后在显微镜（×200）下用BI2000图像分析系统测量其光密度（A）值,每张切片随机检测5个视野,计算出平均A值.
统计学处理: 应用SPSS 11.5软件进行统计分析,数据以x±s表示,资料组间比较用成组t检验，P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1心功能检测术后2 d治疗组与对照组之间LVDd，LVDs，LVEF均无明显差异(P>0.05);术后3 wk治疗组LVEF显著高于对照组，而LVDd和LVDs均明显小于对照组（P <0.05，表1）.
2.2心脏梗死面积测量治疗组梗死面积比对照组缩小［（26.0±0.9）％ vs （28.1±1.5）％，P<0.05］.
表1大鼠急性心肌梗死术后心功能各指标变化(略)
aP<0.05 vs对照组.
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2.3毛细血管密度测量治疗组毛细血管密度与对照组比较差异显著［（10.4±1.5）/视野vs (6.3±0.7)/视野，P<0.05，图1］.
A: 对照组; B: 治疗组.
图1毛细血管密度DAB ×200(略)
2.4心肌组织Bcl2 和Bax蛋白的表达治疗组Bcl2的A值较对照组增强（0.116±0.005 vs 0.103±0.006，P<0.05,图2）; 治疗组Bax的A值较对照组减弱（0.125±0.010 vs 0.147±0.014，P<0.05，图3）.
A: 对照组; B: 治疗组.
图2Bcl2表达DAB ×200(略)
A: 对照组; B: 治疗组.
图3Bax表达DAB ×200(略)
3讨论
促红细胞生成素（EPO）是1948年Bonsdor与Jalsvisto首先发现的一种细胞因子，主要由肾脏皮质及外髓部肾小管周围的毛细血管内皮细胞生成. 目前临床上rHuEPO已广泛应用于慢性肾衰患者贫血的治疗. 对rHuEPO应用的不断发展，推动了对EPO与缺血性疾病之间相互作用的研究［1］.
本研究观察到术后2 d治疗组与对照组之间LVDd，LVDs，LVEF均无明显差异，表明心肌梗死急性期EPO并不能起明显的保护作用. 术后3 wk治疗组LVEF显著高于对照组，而LVDd和LVDs均明显小于对照组. TTC染色表明3 wk后治疗组梗死面积明显小于对照组，以上结果说明EPO对心肌梗死后恢复期起显著的保护作用.
近期研究［4-5］显示了rHuEPO可以增加人类外周血中循环的内皮祖细胞数目，有促进缺血组织新生血管形成的可能. 而另外一些试验［6-8］也显示EPO有促进新生血管形成作用. 应用人类的心肌组织，Jaquet等［7］证实rHuEPO具有与VEGF等效的促进毛细血管生长作用. 本实验中心肌梗死后3 wk免疫组化检查结果显示治疗组毛细血管密度明显强于对照组，说明rHuEPO对心肌梗死恢复期功能的保护作用与促进血管新生有关.
一些试验表明EPO可能在细胞水平保护心肌细胞，减少缺血缺氧心肌细胞凋亡，改善心肌梗死心脏的功能. Calvillo等［3］以低氧条件（5 mmHg氧气）培养大鼠心肌细胞28 h，在培养前30 min加入EPO可以减少50％心肌细胞凋亡；Parsa等［9］证实EPO可以通过PI3K/Akt通路的激活保护H9C2成心肌细胞. Cai等［10］在大鼠心脏缺血再灌注模型上观察到EPO预处理使左心室dp/dt提高3倍，并减少心肌细胞凋亡. Tramontano等［11］ 在大鼠急性心肌梗死模型上观察到EPO具有防止心肌细胞凋亡作用. Calvillo等［2］和Moon等［4］等进一步在不同时间点应用EPO（冠状动脉结扎前24 h，0.5 h，再灌注时、结扎后1 wk每天给予EPO），证实对心肌细胞均有保护作用. 本实验发现治疗组Bcl2较对照组表达明显增强，而Bax较对照组表达明显减弱，反映EPO可以上调Bcl2表达而抑制Bax表达. 目前认为Bcl2和Bax是一对正负调节因子,Bax 蛋白水平高可加速细胞凋亡,Bcl2蛋白和Bax蛋白形成二聚体终止凋亡. 因此调节Bax/Bcl2 蛋白比值可能是EPO 的抗心肌细胞凋亡，改善心肌梗死后心功能的重要原因，但这需要进一步的研究.
总之， EPO可能是通过促进缺血区毛细血管形成及减少心肌细胞凋亡而达到对大鼠的心脏保护功能. 本试验结果提示rHuEPO具有缩小梗死面积、防治急性心肌梗死后心室重构、降低左室扩张及改善左室收缩功能的作用，为临床治疗急性心肌梗死提供了新的方向.
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