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作者：陈旭东，钟小明，陈东丽，赵峰，梅欣明，余鸿
【摘要】 目的探讨宫内缺氧对新生大鼠神经干细胞增殖的影响及当归注射液的保护作用。方法将孕期14 d的SD大鼠随机分为对照组、缺氧组和当归治疗组。缺氧组孕鼠自孕第14天开始每天一次经尾静脉注射生理盐水8 ml/kg（连续7 d），后用低张性缺氧模型致胚鼠宫内缺氧2 h（连续3d：孕期第14，15，16 天）；当归治疗组用250 g/L的当归注射液代替生理盐水，其余处理同缺氧组；对照组不缺氧，其余同缺氧组。孕鼠分娩后立即取新生鼠大脑组织，常规石蜡切片，经巢蛋白（nestin）免疫组织化学染色后行图像分析。结果缺氧组新生鼠海马巢蛋白免疫组化阳性细胞的积分光密度（IOD）值较对照组增加［IOD缺氧组：（14 806±4 636.8）；IOD对照组：（7 387±3191.7），P＜0.05］；当归治疗组新生鼠海马巢蛋白免疫组化阳性细胞的IOD值较缺氧组减弱［IOD治疗组：（9 859±2 386.4）， P＜0.05］。论文论文参考网结论 一定程度的缺氧可刺激神经干细胞增殖；当归注射液对宫内缺氧新生大鼠神经干细胞可能具有保护作用。
【关键词】 当归 缺氧 神经干细胞 增殖
Abstract:ObjectiveTo study the effect of intrauterin hypoxia on the proliferation of neural stem cells(NSCs)from newborn rats and the protective role of Angelica injection on NSCs in a state of hypoxia.Methods14 d-conceiving female SD rats were divided randomly into three groups:control group(CG) ,hypoxia group(HG) and Angelica group(AG) with five rats in each group.Since the fourteenth day of pregnant the rats of HG were injected with Normal Saline through caudal veins (within 7 straight days ; 8ml/kg.d)before intrauterin hypotonic hypoxia (within 3 straight days;on the fourteenth,fifteenth and sixteenth day after pregnancy;2 hours everyday ).Angelica sinensis injection instead of Normal Saline was injected into the rats in the AG ,and other procedures were the same as the HG.No administration of hypoxia was performed in the CG.Their brain tissues of newbom ruts were hamested immediately of newborn rats after childbirth.The expression of nestin in the hippocampus of newborn rats was studied with immunohistochemistry and the results were analyzed by image processing system.ResultsIOD of nestin positive cells in HG was higher than that of the CG(IODHG：14806±4636.8；IODCG：7387±3191.7, P＜0.05)；but in AG,it was lower than that of HG（IODAG：9859±2386.4,P＜0.05）.ConclusionHypoxia can stimulate the proliferation of the NSCs Angelica injection can play a protective role on NSCs from newborn rats with intrauterin hypoxia.
Key words:Angelica a； Hypoxia； Stem cell； Proliferation
宫内缺氧是胚胎发育中的常见症， 是造成脑瘫、癫痫及智力发育迟缓或智力低下的重要原因，神经系统是胚胎发育中出现最早的系统之一 ，因此研究宫内缺氧对神经干细胞的影响具有重要意义。目前国内外神经干细胞增殖的研究多是在体外状态下进行的，在体的研究大多集中在对生后7～14 d的新生鼠夹闭颈总动脉，给予低氧干预。本实验试图通过建立宫内缺氧模型，观察在体状态下缺氧对新生大鼠神经干细胞增殖的影响，并观察中药当归对缺氧状态的调节，为临床长期观察宫内缺氧对新生鼠的影响和治疗宫内缺氧提供实验和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
nestin单克隆一抗购自（CHEMICON公司）、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(棕黄色) 购自武汉博士德生物工程公司；250 g/L的当归注射液购自武汉大学附属第二医院药剂科（批号060926）；OLYMPUS Bx-70荧光显微镜成像系统为日本OLYMPUS光学仪器有限公司生产；德国莱卡切片机；三气培养箱（购自美国REVCO公司），SD大鼠15只（220～250 g）由四川泸州医学院动物科提供（为一级合格动物，许可证号：川实动管质第17号）。
1.2 动物配种与分组
将成年发情期SD雌大鼠15只分别与一只雄鼠合笼饲养，次日8：00见阴栓记雌鼠怀孕0 d，至孕期14 d。孕鼠随机分为对照组、缺氧组和当归治疗组各5只（每只孕鼠产新生鼠5～8只）。
1.3 动物实验
缺氧组孕鼠自孕第14天开始每天1次经尾静脉注射生理盐水8 ml/kg（连续7 d），后用设置好的三气培养箱（氧浓度15%，温度25℃）致胚鼠宫内缺氧2 h（连续3 d：孕期第14，15，16天）；当归治疗组用250 g/L的当归注射液代替生理盐水，其余处理同缺氧组；对照组不缺氧，其余同缺氧组，孕鼠分娩后立即取新生鼠大脑组织，经40 g/L的中性甲醛固定。
1.4 石蜡切片与免疫组织化学
每组随机选取20个新生鼠大脑，然后进行常规石蜡包埋，经海马冠状切面切片（片厚4 μm），切片脱蜡至水，各切片作nestin(1∶200）免疫组化染色(常规链酶亲和素?采?物素?补?氧化物酶复合物法)。
1.5 结果分析与判断
用OLYMPUS Bx-70荧光显微镜成像系统观察每一切片，每张切片均以海马CA3区为观察目标，200×下照相。胞质染成棕色的就是神经干细胞，每例新生鼠选一张切片 ，每张切片均选海马CA3区在200×下观察 1 200个像素（20个像素代表1 μm）线性长度，用Image-Pro Plus图像分析软件分析所选线性长度内组织的积分光密度（IOD），结果以±s表示。
1.6 统计学分析
各组间比较用方差分析，两两比较用LSD法检验。统计处理用SPSS13.0软件完成。
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2 结果
对照组：nestin免疫组化反应阳性细胞质染色棕黄色，细胞稀疏，成一带状分布（图1）。缺氧组：nestin免疫组化反应阳性带细胞密集，细胞带两侧即海马皮质和髓质细胞的数量明显增多（图2），其积分光密度（IOD）值增大，与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）（表1）；当归治疗组：nestin免疫组化反应阳性细胞的分布与缺氧组相似，但与缺氧组相比，阳性细胞的染色明显减弱（图3），其积分光密度（IOD）值减小（P＜0.05）。见表1。表1 3组新生鼠海马CA3区nestin阳性细胞积分光密度（IOD）值(略)
3 讨论
神经系统的早期发生是相当复杂的，也是备受人们关注的胚胎学事件。宫内缺氧是胚胎发育中的常见症，而神经系统细胞对缺氧是最为敏感的，因此，宫内缺氧必然影响胚胎神经系统中神经干细胞的增殖、分裂。
目前宫内缺氧的动物模型，比较成功的是Bjelke法［1］，但此法要对孕鼠进行剖腹手术，术前要使用麻醉药物，这对胚鼠可能造成新的影响。为了使实验条件更易控制，本实验在本研究小组前期的宫内缺氧模型［2］的基础上，采用了智能型三气培养箱代替自制的缺氧缸而制成的持续低张性缺氧的动物模型。实验结果发现：缺氧组新生鼠神经干细胞的nestin免疫组化阳性细胞的积分光密度与对照组之间差异有显著性，说明缺氧后神经干细胞的功能发生了改变，提示该宫内缺氧模型是基本成功的。与Bjelke法相比，此宫内缺氧模型不需对孕鼠进行剖腹手术，避免了手术因素的干扰。与本实验组的前期方 法相比，避免了氧气、二氧化碳浓度、温度和湿度波动对实验结果的干扰。
影响神经干细胞增殖的因素很多，神经干细胞的增殖受自身基因调控和外来信号调控两种机制的影响［3］，本实验中，观察到缺氧3 d（2 h/d）组新生大鼠巢蛋白免疫化反应增强、阳性细胞增多，说明缺氧后神经干细胞表达巢蛋白增加。巢蛋白(nestin)是一种仅存在于神经上皮干细胞的中间丝成分，其表达有特定的时序性［4］。在分裂中期，从核膜溶解到胞质分离，其巢蛋白表达明显增加，尤以末期最高。因此，神经干细胞表达巢蛋白的增强，说明神经干细胞进入了分裂期，是细胞在分裂的表现。缺氧后大脑巢蛋白增加表明缺氧可刺激神经干细胞进入增殖状态 ；神经干细胞在分裂间期，巢蛋白呈卷曲状的长纤维围绕在核周围，巢蛋白形成了笼状结构围绕在染色体周围［5］ 。本实验结果表明，缺氧刺激了胚胎大鼠大脑中更多的神经干细胞从分裂间期进入了增殖期。提示一定时限、程度的缺氧可以刺激神经干细胞的增殖、分裂，这与Yin XJ 等［6］研究的一定时限(3 d)低氧可促进新生鼠的经干细胞的增殖和分化是基本一致的。
当归是应用最广泛的中药之一，它含有阿魏酸、多种磷脂、人体必需氨基酸和微量元素等。本实验发现应用当归注射液组新生大鼠神经干细胞巢蛋白免疫反应阳性细胞数量较缺氧组减少，染色减弱，说明当归注射液减弱了缺氧刺激引起的神经干细胞的增殖和分裂，提示当归对缺氧有保护作用，其机制有待进一步研究，可能与以下几方面有关［7，8］，①扩张血管、改善微循环。当归挥发油缓解血管平滑肌的痉挛，扩张血管，从而减少血管阻力，增加外周血流量，改善局部微循环，使胚胎缺氧得以改善。②对子宫的调节作用。当归抑制子宫平滑肌收缩，降低对宫血管的压迫，增加子宫血流量，从而增加胎盘的物质交换量。③清除氧自由基和抗脂质过氧化作用。细胞缺血缺氧时发生能量代谢失常、钙超载和氧自由基生成。阿魏酸是当归抗氧化作用的有效成分。综上分析，当归注射液可能通过扩张血管、抑制子宫平滑肌收缩，从而改善胚胎大鼠的缺氧状态，并通过清除氧自由基，减少神经干细胞的钙超载，导致了神经干细胞内巢蛋白合成减少，从而减弱神经干细胞的增殖、分裂，从而对缺氧引起的细胞过快增殖起到保护作用。
【参考文献】
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