【www.tuzhexing.com--医学类】
【摘要】 目的： 研究异丙酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中细胞凋亡的影响. 方法： SD大鼠60只，体质量290~310 g,随机分为假手术组、异丙酚组和对照组，每组20只. 用改良Longa法制成鼠脑缺血/再灌注模型（缺血2 h，再灌2 h）,光镜下观察细胞形态学变化，TUNEL法观察细胞凋亡变化. 结果： 光镜检查异丙酚组细胞肿胀坏死明显减轻，凋亡细胞及坏死细胞明显减少. 再灌2 h后对照组凋亡细胞比率、凋亡细胞阳性率、TUNEL阳性率均较假手术组高(P<0.01)，异丙酚组凋亡细胞阳性率、TUNEL阳性率较对照组减少（P<0.05）. 结论： 异丙酚能减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，具有抑制神经细胞凋亡坏死的作用.
【关键词】 二异丙酚；大鼠；脑缺血 ；再灌注损伤
0引言
异丙酚能降低脑血流量、脑耗氧量和颅内压,是临床上脑损伤外科手术麻醉以及脑中风患者躁动镇静的常用药物之一. 研究证实,麻醉剂量异丙酚对实验性大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用［1］,也有实验发现,镇静剂量异丙酚能明显改善大鼠脑缺血的形态学变化［2］ . 其作用机制是多途径、多位点的，包括直接清除自由基、抑制脂质过氧化作用、还原高氧化铁蛋白、调节钙离子平衡等，还有抑制缺血部位兴奋性氨基酸的释放. 但对缺血再灌注后的细胞凋亡机制报道较少. 本实验旨在探索异丙酚对大鼠缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响.
1材料和方法
1.1材料健康雄性SD大鼠60只，体质量290~310 g（西安交通大学医学院动物实验中心提供），随机分为3组： 异丙酚组、对照组、假手术组，每组20只. 用改良Longa法［3］：大鼠腹腔注射100 mL/L水合氯醛300 mg/kg麻醉,颈部正中切口,分离左颈总动脉及其分叉处, 凝断颈外动脉(ECA)的3个主要分支,游离ECA,两端结扎,靠近远心端将其剪断,取4??0尼龙线尖端靠近热源烫钝呈鼓锤状置入ECA,用丝线扎紧,将尼龙线由ECA插入颈内动脉(ICA),深度为17~22 mm. 此时大脑中动脉(MCA)起始处被阻断,同时也阻断了来自ICA,ACA,PCA的侧副血流,导致MC区局部缺血，完成局灶脑缺血步骤. 脑缺血成功的标志为动物苏醒后出现同侧的Horner征和对侧以前肢为重的偏瘫. 缺血2 h后拨出尼龙线恢复MCA血流,完成再灌注步骤. 手术过程观察呼吸节律,用加热灯保持大鼠肛温(37±0.5)℃. 假手术组仅将尼龙线放入ECA,其他操作相同. 异丙酚组于缺血前10 min腹腔注入异丙酚100 mg/kg（英国阿斯利康公司提供）. 对照组于缺血前腹腔注入等容积生理盐水. 再灌注2 h后，开颅取脑，置入40 g/L甲醛溶液中固定.
1.2方法
1.2.1细胞光镜观察灌注后2 h后，断头取脑，以视交叉前后两点冠状切片，片厚约4 mm，将脑片放入40 g/L甲醛溶液中固定.常规梯度脱水、透明、包埋、浸蜡、切片厚6 μm. HE染色，切片常规脱蜡至水，苏木精染色5 min，盐酸乙醇分色30 s，伊红复染1~2 min，水洗、脱水、透明、中性树胶封片，观察组织学变化.
1.2.2细胞凋亡检测（TUNEL法）原位末端标记细胞凋亡试剂盒由德国Boehringer Mannheim公司提供. 切片常规脱蜡至水，按试剂盒说明书操作，DAB显色2~5 min，苏木素复染、封片. 于光镜下观察，TUNEL染色阳性并伴有核染色质浓聚、核染色质靠边凝集或凋亡小体形成者为凋亡细胞；TUNEL染色阳性但呈弥漫着色为坏死细胞；TUNEL染色阴性为正常细胞. 光镜下随机选取每张切片梗死周边组织五个视野，分别计数每1000个细胞中TUNEL阳性、凋亡细胞、坏死细胞数，计算TUNEL阳性细胞的百分率. TUNEL阳性细胞百分率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%. 凋亡细胞阳性率=凋亡细胞/（TUNEL阳性细胞+TUNEL阴性细胞），凋亡细胞比率=凋亡细胞/（凋亡细胞+坏死细胞）×100%.
统计学处理： 数据以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件，采用非参数秩和检验分析组间差异. P<0.05有统计学差异.
2结果
2.1形态学改变HE染色下，对照组相当于缺血中心区的顶叶、颞叶区神经细胞染色淡，出现细胞肿胀，细胞核碎裂、溶解等细胞坏死特征（图1A）. 相当于缺血半暗带的额叶皮质等区神经细胞数量减少、体积缩小，部分胞浆成嗜酸性改变，细胞间隙增宽，细胞核固缩，染色质浓缩，边聚. 假手术组切片未出现上述变化. 异丙酚组部分皮质部神经元结构完整，坏死细胞和凋亡细胞减少（图1B）.<
A：对照组； B：异丙酚组.
图1神经细胞凋亡TUNEL ×400（略）
2.2细胞凋亡对照组皮质和纹状体都可见大量凋亡细胞，核固缩、碎裂较多. 假手术组未见凋亡细胞. 异丙酚组部分细胞核固缩、可见核碎裂，部分细胞可见核仁，与对照组相比，凋亡细胞减少（P<0.05，表1）.
表1再灌注2 h凋亡细胞比率、凋亡细胞阳性率和TUNEL阳性率（略）
论文参考网
aP<0.05 vs对照， bP<0.01 vs假手术.
3讨论
异丙酚能减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，具有抑制神经细胞凋亡坏死的作用. 异丙酚能减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，具有抑制神经细胞凋亡坏死的作用. 缺血性脑损伤的机制研究已久，研究表明，在脑缺血前10 min腹腔注射异丙酚100 mg/kg，对大鼠脑缺血再灌注有保护作用［4］. 近年来的研究表明细胞程序性的死亡即细胞凋亡在缺血再灌注损伤中起了重要的作用，细胞凋亡是神经细胞死亡的主要形式，重度长时间缺血引起神经细胞坏死，轻度短时间缺血及再灌注可引起神经细胞发生凋亡［5］. 有研究表明，异丙酚对局灶脑缺血再灌注损伤的保护作用与抑制神经细胞凋亡有关［6］，异丙酚在再灌注后6 h~3 d抑制细胞凋亡的作用最明显［7］. 异丙酚作为一种应用多年的兼具镇静和麻醉作用的药物被报道具有脑保护作用，其机制包括直接清除自由基、抑制脂质过氧化作用、还原高氧化铁蛋白、调节钙离子平衡等，还有抑制缺血部位兴奋性氨基酸的释放. 现有关于异丙酚抑制细胞凋亡的研究报道不一，大多关于其在细胞凋亡反应进程中不同时段的作用. 本实验表明缺血2 h再灌2 h时，出现神经细胞水肿坏死、凋亡等病理改变. 缺血中心已坏死为主，缺血半暗带以凋亡为主，应用异丙酚组凋亡细胞明显减少，说明异丙酚对中心区和半影区神经细胞凋亡有一定的抑制作用. 其确切的分子机制及在不同时程中的作用还有待于进一步探索.
Gavrieli等［8］报道了用光镜原位识别凋亡细胞的方法??TUNEL法，标记核被染成棕色，普通光镜下很容易观察，是检验细胞凋亡常用的方法之一. TUNEL染色可识别细胞凋亡，然而坏死细胞的DNA碎片也可以呈现TUNEL阳性，因此单凭TUNEL阳性不能认定凋亡细胞，必须根据形态学特征加以鉴别. 本试验将符合凋亡特征性表现的细胞与一般TUNEL阳性细胞区分开来，分别观察TUNEL阳性率、凋亡细胞阳性率、凋亡细胞比率，以降低凋亡细胞假阳性的误差，提高了试验结果的可靠性.
【参考文献】
［1］蔡英敏,王美钠,薛荣亮. 麻醉剂量异丙酚对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］. 中华麻醉学杂志,2001,21(3):160-162.
［2］蔡英敏,王美钠,马小亚. 镇静剂量异丙酚对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的形态学研究［J］. 西安医科大学学报,2001,22(3)：260-261.
［3］Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats ［J］.Stroke, 1989, 20(1):84-91.
［4］郭建荣，崔健君，贾有海，等. 异丙酚对大鼠脑缺血/再灌注时脑组织c??fos基因表达的影响［J］.中华麻醉学杂志，2003,23:111-114.
［5］Pulsinelli W. Pathophysiology of acute ischemic stroke［J］. Lancet, 1992,26:1252-1258.
［6］杨宾侠，王永利，赵砚丽. 异丙酚对大鼠局灶性脑缺血/再灌注后细胞凋亡的影响［J］.中华麻醉学杂志，2003,23:288-290.
［7］陈莲华，薛张纲，蒋豪. 异丙酚对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑细胞凋亡经时反应进程的影响［J］.中华麻醉学杂志，2005，10，25（10）:765-767.
［8］Gavrieli Y, Ben??Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation［J］. J Cell Biol, 1992,119:493-501.