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作者：易方方，唐其柱，冯斯婷，王腾
【关键词】 白藜芦醇；全细胞膜片钳；钙电流
Effects of resveratrol on Ltype calcium current in isolated ventricular myocytes of guinea pig
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of resveratrol on the Ltype calcium current (ICaL) in isolated ventricular myocytes of guinea pig. METHODS: Single ventricular cell was obtained from healthy guinea pig heart using enzymatic dissociation methods. The wholecell patch clamp was used to record the ICaL following the administration of resveratrol at 1, 50, 100 μmol/L. RESULTS: ① Resveratrol reduced the ICaL in a concentrationdependent manner, but it had no effect on IV shape of ICaL. ② Resveratrol markedly shifted the steadystate activation curve of ICaL to the right, and V1/2 value increased from (-18.97±4.08) mV in control to (-15.97±4.13) mV in the presence of resveratrol （n=7, P=0.02）, the κ value from (3.64±0.56) to (3.82±0.60) (n=7，P=0.67). ③ Inactivation curve of ICaL was not affected significantly. ④ The time constant of reactivation of ICaL was reduced from (98.50±9.00) ms to (54.53±4.27) ms (n=6，P=0.000) by resveratrol. CONCLUSION: Resveratrol inhibited the Ltype calcium channel, mainly acting on the activity and recovery processes.
【Keywords】 resveratrol；wholecell patch clamp；calcium current
【摘要】 目的：研究白藜芦醇对正常豚鼠心室肌细胞L型钙电流（ICaL）的影响. 方法：采用全细胞膜片钳技术,记录不同浓度白藜芦醇作用前后对ICaL的影响. 结果：①白藜芦醇呈浓度依赖性阻断ICaL,但对激活电位、峰电位、反转电位均没有影响；②白藜芦醇使ICaL稳态激活曲线右移，V1/2由对照的（-18.97±4.08） mV变为（-15.97±4.13） mV （n=7，P=0.02），κ由（3.64±0.56）变为（3.82±0.60）（n=7，P=0.67）；③对失活曲线无影响，不改变ICaL失活特性；④白藜芦醇使ICaL失活后再恢复时间常数τ缩短，从（98.50±9.00） ms变为（54.53±4.27） ms（n=6，P=0.000）. 结论：白藜芦醇对ICaL有阻断作用,主要作用于钙通道激活和恢复过程.
【关键词】 白藜芦醇；全细胞膜片钳；钙电流
0引言
白藜芦醇化学名为3,5,4′三羟基反二苯代乙烯(3,5,4′ trihydroxyrans stilbene)，是一种主要存在于葡萄皮、花生中的多酚类植物抗毒素. 现认为它是适量饮用葡萄酒有利于心血管健康的主要作用因子［1］. 大量研究［2-3］发现白藜芦醇对心肌缺血－再灌注损伤有保护作用；对血管有广泛的舒张效应［4］;能抗动脉粥样硬化，防治冠心病［5］. 但其对心肌细胞离子通道的作用少见报道，我们采用膜片钳技术研究白藜芦醇对心室肌细胞ICaL的影响.
1材料和方法
1.1材料健康成年豚鼠31只（武汉大学医学院动物中心），体质量25 50~350 g，雌雄不拘； I型胶原酶，蛋白酶E,HEPES（Gibco公司）； CSOH, CSCl, Na2ATP（Sigma公司）；白藜芦醇（西安赛得高科生物股份有限公司）；其余均为国产分析纯. 无钙台氏液 (mmol/L)：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl2 1，NaH2PO4 0.33，Glucose 20，HEPES 10，pH 7.38 (NaOH调节);KB液(mmol/L)： glumatic acid 50，KOH 85，KCl 30，MgSO4 3，Taurine 20，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 0.5，pH 7.2(KOH调节)；电极外液组成(mmol/L)：NaCl 37，Choline Chloride 100，CaCl2 1.8，MgCl2 0.5， HEPES 10，Glucose 10，CSCl 4.6，pH 7.3(CSOH调节)；电极内液组成(mmol/L): CSCl 120， CaCl2 1.0， MgCl2 5， Na2ATP 5，EGTA 11， HEPES 10，Glucose 11，pH 7.4(CSOH调节). 白藜芦醇在DMSO中配成1.5 mmol/L母液，每次实验时,母液溶于电极外液中配成实验所需终浓度进行灌流,DMSO终浓度低于1 mL/L.
1.2方法
1.2.1心室肌细胞的分离将豚鼠腹腔注射肝素500 U/kg，头部击昏,迅速开胸取出心脏置于1000 mL/L O2饱和的4℃生理盐水中冲洗，剪开心包，连接于Langendorff心脏灌流装置上逆行灌流，灌流压维持在70 mm H2O，用无钙台氏液灌流3～5 min，冲出心脏内残留血液，心脏完全停跳后，改用含0.33 mg/L Ⅰ型胶原酶，0.1 mg/L蛋白酶E的低钙液（Ca2+ 80 mmol/L）灌流3~5 min,至心脏膨大松弛流出液成丝后取下，除去心房，在含BSA 1 g/L的KB液中剪碎心室肌，37℃温孵，稀释，倒出上清液, 此为第一份细胞贮存液. 剩余的沉淀部分继续用KB液温孵，稀释，倒出上清依次可以得到多份细胞存储液. 灌流液始终给予1000 mL/L O2饱和,循环水浴使灌流液保温在37℃左右.
1.2.2全细胞记录技术吸数滴细胞保存液加于1.5 mL灌流槽，置于倒置显微镜（Olympus IX70）载物台上，待细胞静置贴壁，细胞外液灌流清洗细胞，电极选用硬质玻璃(上海神经生理所提供),经微电极拉制(Narishige PB7)二次拉制而成,电极充以内液后阻抗3.5～5 MΩ. 选取横纹清晰，表面无颗粒，无收缩的细胞，采用微电极操纵仪(Narishige MD320)移动电极，当电极尖端与细胞表面形成高阻抗封接后（＞2 GΩ）,补偿电极与细胞膜之间的电容,进一步给负压吸破细胞膜,经电容电流和电极串联补偿即可行全细胞记录. 所有实验均在室温下进行.
1.2.3试验分组共分为4个浓度组,分别为对照组（n=8）,1 μmol/L（n=9）,50 μmol/L（n=7）,100 μmol/L（n=7），记录药物灌流前后ICaL ，50 μmol/L组还需记录通道激活，失活和失活后恢复电流.
统计学处理：数据分析采用pulse 8.31软件对全细胞记录进行图形与数据转换，数据以x±s表示，origin 6.0软件对数据进行统计学处理，并进行曲线拟合. 不同浓度药物作用前后间比较采用Oneway ANOVA检验及LSDt，50 μmol/L白藜芦醇作用后通道动力学改变采用t检验，P<0.05为有统计学差异.
2结果
2.1对ICaL浓度依赖性阻断作用采用保持电位-40 mV,指令电压-40～＋60 mV,钳制时间200 ms，阶跃10 mV的刺激程序引出ICaL，并且记录30 min内“rundown”现象（n=7），得出在12 min内衰减明显，所有的电流记录均在电流稳定后进行. 灌流给药5 min后药效稳定. 结果显示白藜芦醇（1～100 μmol/L）对ICaL呈浓度依赖性阻断作用，0,1,50,100 μmol/L作用时ICaL峰值分别为（0.79±0.05），（0.55±0.05），（0.42±0.05）,（0.17±0.04 ）nA (F=159.104,P=0.000;多重比较后，任两组间P=0.000，图1）. 白藜芦醇作用后洗脱，ICaL大部分恢复（图2）.
论文参考网
a：给药前; b：1 μmol/L白藜芦醇; c：50 μmol/L白藜芦醇; d：100 μmol/L白藜芦醇.
图1不同浓度白藜芦醇对I CaL的影响（略）
a：给药前; b：50 μmol/L白藜芦醇;c：洗脱后.
图2白藜芦醇作用及洗脱后对ICaL的影响（略）
2.2对电流电压曲线的影响从保持电位-40 ｍV逐步去极化至+60 ｍV,阶跃为10 ｍV,持续时间200 ms. 50 μmol/L藜芦醇作用后，对钙电流的最大激活电位和反转电位均无影响，但使最大峰值电流降低（56.20±2.50）％（n=5，P＝0.000，图3）.
图350 μmol/L白藜芦醇对ICaL的IV曲线的影响（略）
2.3对稳态激活动力学曲线的影响根据上述脉冲刺激得到的电流值,按Boltzmann方程进行拟合:G/Gmax=1/［1+exp(VＴ－V1/2/κ)］. (G为电导,V1/2为曲线中点的电压,κ为曲线的斜率). 给予50 μmol/L白藜芦醇前后，V1/2/分别为（-18.97±4.08），（－15.97±4.13）ｍV（n=7，P=0.02）, κ分别为3.64±0.56，3.82±0.60（n=7，P=0.67）. 白藜芦醇能使激活曲线明显右移（图4）.
图4白藜芦醇对ICaL激活曲线的影响（略）
2.4对稳态失活动力学曲线的影响采用双脉冲刺激法，保持电位为-60 ｍV,开始逐步去极化至+30 ｍV,阶跃10 ｍV,持续1 ｓ；在每次条件脉冲后都紧跟一个固定的去极化至10 ｍV,持续300 ｍｓ的脉冲,然后回到-60 ｍＶ. 将记录到的ICaL值经Boltzmann方程拟合I/Imax=1/［1+exp(VＴ-V1/2/κ)］. 50 μmol/L白藜芦醇作用前后，V1/2/分别为（－20.17±1.17），（－20.81±0.75）ｍV（n=8，P=0.20）, κ分别为7.16±1.04，6.97±0.67（n=8，P=0.90）. 因而白藜芦醇对ICaL稳态失活曲线无影响（图5）.
图5白藜芦醇对ICaL失活曲线的影响（略）
2.5对失活后恢复动力学曲线的作用采用双脉冲刺激法. 保持电位为-60 ｍＶ,给予去极化至10 ｍＶ的刺激,持续250 ｍｓ,回到保持电位持续50 ｍｓ后,再给予同样刺激,前后两个脉冲的间隔时间逐渐增加,每次增加50 ｍs,共9次脉冲. 加药前得到的曲线可以用单指数方程拟合. 给药前后的时间常数（τ）为（98.50±9.00），（54.53±4.27）ms( n=6，P=0.000，图6）.
图6白藜芦醇对ICaL失活后恢复曲线的影响（略）
3讨论
ICaL在心肌细胞电活动中起重要作用. 它是维持一个较长平台期的主要内向电流，为其他离子流的活动提供合适的电位条件. 钙通道阻滞剂不仅可以减少细胞内钙离子浓度，减少钙超载的发生，减少降解酶类的激活释放而引起的的心肌缺血再灌注损伤；还可以缩短APD，减少兴奋性折返引起的早后去极化，减少心律失常的发生.
白藜芦醇的研究最早始于“法国悖论”现象，即法国人喝大量葡萄酒，血液中饱和脂肪酸几乎是其他发达国家的四倍，但是罹患心脏病的危险确只是后者的三分之一［6］. 研究表明这种现象与葡萄酒中的一种称为白藜芦醇的物质有着密切关系，它可以减少心肌缺血再灌注损伤、舒张血管、抗动脉粥样硬化等. 白藜芦醇作为钙通道阻断剂减少胞内钙超载的特点进一步揭示其发挥心肌保护作用的机制. Pakaki等［7］研究发现预先给予大鼠不同剂量的白藜芦醇进行干?，可以不同程度的减少心肌缺血再灌注后室早室颤的发生率. 本试验可以进一步解释此研究结果，白藜芦醇作为钙通道阻断剂可以减少兴奋折返，减少心律失常的发生.
本实验不足之处是仅就正常心室肌细胞的钙通道进行研究，对于病理状态如缺血缺氧，以及其他通道如钠，钾，氯通道及其各种亚型，和细胞膜上的各种离子泵的作用还有待进一步研究.
【参考文献】
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［4］ ElMowafy AM. Resvertrol activates membranebround guanylyl cyclase in coronary arterial smooth muscle: A novel signaling mechanism in support of coronary protection［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 291(5) :1218-1224.
［5］ Wang Z, Huang Y, Zou J, et al. Effects of red wine and wine polyphenol resvertrol on platelet aggregation in vivo and in vitro［J］. Int J Mol Med, 2002, 9(1):77-79.
［6］ Rasmussen SE, Frederiksen H, et al. Dietary proanthocyanidins: occurrence, dietary intake, bioavailability, and protection against cardiovascular disease［J］. Mol Nutr Food Res, 2005, 49(2):159-174.
［7］ Pakaki T, Bak I, Kovacs P, et al. Grape seed proanthocyanidins improved cardiac recovery during reperfusion after ischemia in isolated rat heart［J］. Am J Clin Nutr, 2002, 75(5): 894-899.