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作者：赵勇，高建飞，章必成，杜光祖
【关键词】 结直肠癌
Cks1, P27Kip1 and Skp2 protein expression in colorectal cancer
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of Cks1 protein and its relationship with the expressions of Skp2, P27Kip1 and colorectal tumorigenesis. METHODS: Flow cytometry was used to detect the expressions of Cks1, Skp2 and P27Kip1 in 20 normal colorectal mucosas, 20 adenomas as well as 54 colorectal cancers. RESULTS: The expressions of Cks1 and Skp2 gradually increased in the order of normal mucosa, adenoma to colorectal cancer (P<0.05), while the expression of P27Kip1 gradually decreased in the same order (P<0.05). A strong correlation was found between the expressions of Cks1 and Skp2 (r=0.845, P<0.05) and a significant inverse relation was also observed between the expressions of Cks1 or Skp2 and of P27Kip1 (r=-0.752, P<0.05; r=-0.746, P<0.05 respectively). The expression of Cks1 was significantly associated with the loss of tumor differentiation (P<0.05), but not with lymph node metastasis and Dukes staging (P>0.05). CONCLUSION: Cks1 may play an important role in human colorectal tumorigenesis. Cks1 may be an essential factor in proteasomedependent degradation of P27Kip1 regulated by Skp2.
【Keywords】 colorectal neoplasms; cyclin kinase subunit 1; S phase kinase protein 2; P27Kip1 protein; ubiquitin
【摘要】 目的： 探讨Cks1在结直肠癌发生及其在Skp2调节P27Kip1降解过程中的作用. 方法： 应用流式细胞术测定正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤和结直肠癌组织中Cks1, P27Kip1和Skp2蛋白的表达. 结果： 由正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤到结直肠癌Cks1, Skp2表达呈上升趋势(P＜0.05)，P27Kip1表达呈下降趋势(P＜0.05). 结直肠癌中Cks1, Skp2表达与P27Kip1表达呈负相关(r=-0.752, P＜0.05; r=-0.746, P＜0.05)；Cks1与Skp2呈正相关（r=0.845, P＜0.05）. 结直肠癌中Cks1的表达与肿瘤分化程度相关（P＜0.05），而与淋巴结转移及Dukes分期不相关（P＞0.05）. 结论： Cks1可能参与了结直肠癌的发生；结直肠癌中Cks1可能参与了Skp2调节P27Kip1泛素化降解过程.
【关键词】 结直肠肿瘤；Cks1蛋白；Skp2蛋白；P27Kip1蛋白；泛素
0引言
许多恶性肿瘤中细胞周期性蛋白P27Kip1的表达是降低的，Fbox蛋白S phase kinase protein 2 （Skp2)参与了P27Kip1泛素化降解过程. Cyclin kinase subunit 1 （Cks1)是高度保守的细胞周期调节蛋白Suc1/Cks家族成员之一，只有结合Cks1后，才能识别P27Kip1进 进行泛素化蛋白降解［1］. 而Cks1在肿瘤组织中尤其在结直肠癌组织中的表达及其与P27Kip1, Skp2间的关联性罕见报道. 我们用流式细胞仪检测了正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤和结直肠癌中Cks1, P27Kip1和Skp2的表达.
1材料和方法
1.1材料
手术切除病理证实的结直肠癌标本54例，结直肠腺20例及正常结直肠黏膜20例. 术前均未行放化疗或免疫治疗. 结直肠癌患者男29例，女25例，年龄24~76（平均52.4±8）岁；Dukes A期5例，B期22例，C期18例，D期9例；有淋巴结转移26例，无转移28例. Cks1兔抗人mAb及Skp2鼠抗人mAb购自美国ZYMED公司，P27Kip1鼠抗人mAb购自丹麦DAKO公司.
1.2方法
新鲜组织块1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm, PBS洗净，机械破碎法制成单细胞悬液，0.5 mL加入两只小试管，PBS液洗涤1次，离心，弃上清，试管内加入兔抗人Cks1（或P27Kip1, Skp2）荧光mAb 10 μL，对照管加入PBS，混匀，4℃孵育30 min, PBS洗涤1次，离心，清除多余未结合抗体后上机检测. 每1标本检测1×105个细胞. Cks1（或P27Kip1, Skp2）阳性率={［试管中Cks1（或P27Kip1, Skp2）阳性细胞数－阴性对照阳性细胞数］/10 000}×100%.
统计学处理： 数据用x±s表示，采用SPSS 10.0统计分析软件，3组间样本比较应用方差分析，各组间两两比较采用SNKq检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析，P<0.05为有显著性差异.
2结果
从正常肠黏膜、结直肠腺瘤到结直肠癌组织Cks1, Skp2蛋白表达呈上升趋势(P＜0.05)；而P27Kip1呈下降趋势(P＜0.05，表1）. 结直肠癌组织中Cks1表达与癌组织分化程度相关，低分化者Cks1表达率明显高于中、高分化者［(49.5±5.6） vs （42.7±6.2）和（41.5±4.8）, P＜0.05］，而与结直肠癌患者年龄、性别，淋巴结转移和Dukes分期无关.
结直肠癌组织中Cks1蛋?表达与Skp2蛋白呈正相关（秩相关系数r=0. 845, P＜0.05）；与P27Kip1蛋白负相关(r=-0.752, P＜0.05)；结直肠癌组织中Skp2蛋白与P27Kip1蛋白负相关(r=-0.746, P＜0.05). 在54例结直肠癌中，21例Cks1, Skp2同时高表达，P27Kip1低表达，14例Cks1, Skp2同时低表达，P27Kip1高表达；但3例Skp2, P27Kip1同时高表达，Cks1低表达；2例Skp2, P27Kip1同时低表达，Cks1高表达.表1Cks1, P27Kip1和Skp2在结直肠癌中的表达(略)
2.8腺瘤〖〗20〖〗32.5±4.4〖〗44.5±5.2〖〗42.2±4.6癌〖〗54〖〗45.2±6.2a〖〗15.3±3.3a〖〗60.2±5.5aaP＜0.05 vs正常黏膜和腺瘤.
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3讨论
细胞周期调节失控是肿瘤发生、发展的重要分子事件. 作为细胞周期负性调节因子的P27Kip1，其活性改变影响细胞周期进程，进而影响细胞增殖，与肿瘤发生、发展密切相关. 泛素蛋白水解酶途径调节是P27Kip1蛋白降解的主要机制. 一些恶性实体瘤中P27Kip1常呈低表达，而Skp2高表达，P27Kip1的表达与Skp2负相关［2-3］. 本研究显示从正常肠黏膜、结直肠腺瘤到结直肠癌组织Skp2蛋白表达呈上升趋势，P27Kip1呈下降趋势；结直肠癌组织中Skp2蛋白与P27Kip1蛋白负相关. 这一结果支持P27Kip1, Skp2参与了结直肠癌的发生及Skp2参与了P27Kip1泛素化降解过程的推论. 但本实验还发现5例Skp2, P27Kip1同时高表达或Skp2，P27Kip1同时低表达. Dowen等［4］发现50%的宫颈癌组织中P27Kip1, Skp2同时高表达或低表达. Hara等［5］发现在缺乏Skp2的胞质内，仍可检测到P27Kip1的泛素化活动，说明细胞质内可能存在P27Kip1其他泛素化途径. 我们发现从正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤到结直肠癌组织Cks1蛋白表达呈上升趋势，结直肠癌中Cks1的表达与肿瘤分化程度相关，这说明Cks1可能参与了结直肠癌的发生，Cks1蛋白表达增多，使得结直肠癌细胞脱离了原有的正常生长周期调控，细胞呈无节制生长状态，Cks1表达越多，细胞分化程度越 低，肿瘤恶性程度越高. 同时我们还发现3例Skp2, P27Kip1同时高表达，Cks1低表达；2例Skp2, P27Kip1同时低表达，Cks1高表达. 虽然没有统计学意义，但这也说明Cks1是P27Kip1降解所必需的.
【参考文献】
［1］ Sitry D, Seeliger MA, Ko K, et al. Three different binding sites of Cks1 are required for p27ubiquitin ligation ［J］. J Biol Chem, 2002,277(44):42233-42240.
［2］ Lim MS, Adamson A, Lin Z, et al. Expression of Skp2, a p27(Kip1) ubiquitin ligase, in malignant lymphoma: Correlation with p27(Kip1) and proliferation index ［J］. Blood, 2002,100(8):2950-2956.
［3］ Yokoi S, Yasui K, Saito Ohara F, et al. A novel target gene, SKP2, within the 5p13 amplicon that is frequently detected in small cell lung cancers ［J］. Am J Pathol, 2002,161(1):207-216.
［4］ Dowen SE, Scott A, Muknerjee G, et al. Overexpression of Skp2 in carcinoma of the cervix does not correlate inversely with p27 expression ［J］. Int J Cancer, 2003,105:326-330.
［5］ Hara T, Kamura T, Nakayama K, et al. Degradation of p27(Kip1) at the G(0)G(1) transition mediated by a Skp2independent ubiquitination pathway ［J］. Biol Chem, 2001,276(52):48973-48942.