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作者：沈诗军 周定刚 黎德兵
【摘要】 目的观察走马胎提取液对血栓病理模型SD大鼠体内凝血系统和血液流变学的影响，以初探其抗血栓的作用机制。方法利用0.01%AD复制血栓模型，测定SD大鼠的PT，TT，APTT，RT，Fg，全血黏度和血液生理指标。结果与正常组相比较，病理模型组SD大鼠体内PT，APTT显著缩短(P<0.05)，血浆Fg含量明显升高(P<0.05)，全血低切率(6 r/min和12 r/min)黏度显著上升(P<0.01或P<0.05)；与病理模型组相比较，高剂量组SD大鼠体内PT，TT和APTT显著延长(P<0.05)，血浆Fg含量极显著降低(P<0.01)，高、中、低剂量组全血低中切率(6，12 r/min和30 r/min)黏度显著下降(P<0.01,P<0.05)。结论走马胎提取液能有效地延长血栓模型大鼠体内PT，TT和APTT以及降低全血黏度及血浆Fg含量，影响机体内、外源性凝血系统从而发挥其抗凝血作用。
【关键词】 走马胎提取液 血液流变学 病理模型 血栓
Abstract：ObjectiveTo observe the effects of Ardisia gigantifolia Stapf extract on blood clotting system and hemorrheology and its mechanism.MethodsThe model of thrombus was induced by 0.01%AD stimulation and PT，TT，APTT，Fg，blood viscosity and blood physiologic. ResultsCompared with 0.9%NaCl control group, pathological model control group could significantly shorten PT and APTT(P<0.05),increase the content of Fg and blood low shearing rate(6 r/min and 12 r/min)viscosity(P<0.01,P<0.05);Compared with pathological model control group,high dose groups could significantly prolong PT,TT and APTT(P<0.05), significantly decrease the content of Fg and blood high middle low shearing rate(6，12 r/min and 30 r/min) viscosity(P<0.01,P<0.05). ConclusionArdisia gigantifolia Stapf extract can prolong PT,TT,and APTT,and also decrease blood viscosity and the content of Fg,furtherly affected intrinsic and extrinsic coagulation system to prevent from thrombosis.
Key words：Ardisia gigantifolia Stapf extract； Hemorrheology； Pathological model； Thrombus
走马胎又名大叶紫金牛［1］、走马风［2］、豆收［3］，学名Ardisia gigantifolia Stapf，为紫金牛科紫金牛属植物，全株具有活血化淤、祛风湿壮筋骨、止血生肌等功效［4］，为民间常用的跌打伤科药。论文学术科研网尽管临床上已使用，但对该科属植物的研究报道很少，目前有关走马胎的抗血栓药理作用研究国内外尚未见报道。据此，本实验应用小剂量肾上腺素连续多次给药，模拟长期疼痛紧张焦虑应激反应导致机体内血栓形成［5］，初步探讨走马胎提取液对SD大鼠体内血栓形成的影响。
1 材料与仪器
1.1 药品与试剂 走马胎(产地:四川)，购于德仁堂药业有限公司；血塞通片(Panax notoginseng Saponins,PNS)主要成分三七总皂苷，维和制药有限公司，批号:20060523；盐酸肾上腺素(adrenalin，AD)注射液，重庆迪康长江制药有限公司，批号:051102；凝血酶，三九集团昆明白马制药有限公司，批号:041201；牛纤维蛋白原(fibrinoge en，Fg)，中国药品生物制品检定所；白陶土，成都博瑞克生物技术；兔脑粉(凝血活酶)和脑磷脂自制。
1.2 动物 清洁级SD大鼠，♀♂各半，体重(260±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限公司。实验动物自由采食、饮水(自来水)，投喂标准颗粒大鼠饲料。
1.3 仪器Universal 320R冷冻离心机，Hettich生产；UV-2000紫外分光光度计，Unico生产；CA620全自动血细胞分析仪，Medonic生产；NXE-1B型椎板粘度计，成都仪器厂生产；电热恒温水浴箱，北京中兴伟业仪器厂生产；旋转蒸发仪，巩义市英峪高科仪器厂生产。
2 方法
2.1 药品制备方法 每次取干燥走马胎100 g，先用60%乙醇室温浸泡24 h后,第一次加10倍量60%乙醇回流2.5 h，第二次8倍量60%乙醇回流2 h，合并提取液，旋转蒸发浓缩至10 ml，置4 ℃保存备用。临用前用生理盐水配制成不同浓度溶液。
2.2 模型复制及给药［5］ 取SD大鼠36只，随机分为正常、模型、PNS药物对照组，同时设走马胎提取液高、中、低剂量组(分别为10 g生药/kg，5 g生药/kg，2.5 g生药/kg；简称高剂量组、中剂量组和低剂量组。下同)。除正常组外，将其它各组大鼠分别用0.015%AD，按0.08 mg/kg皮下注射，1次/d，连续12 d(正常对照组注射相同体积的生理盐水)复制血栓病理生理模型。最后1天造模8 h后，分别灌胃给药，1次/d，连续12 d，给药容积1 ml/100 g，正常和模型组给予等体积的生理盐水。
2.3 大鼠体内凝血酶原时间(prothrombin time,PT)的测定［6］ 分别对各组大鼠进行断头采血7.2 ml，加入相应盛有0.109 mol/L枸橼酸钠溶液0.8 ml的离心管内混匀, 取抗凝血4.5 ml，以3 000 r/min离心10 min, 分离乏血小板血浆，分装后放入-70 ℃备用。取内径1 cm的试管3支, 每管加入凝血活酶和血浆各0.1 ml，混匀，置37℃水浴中温育30 s,然后加入0.025 mol/L CaCl2溶液0.1 ml，混匀后立即开始计时。每隔2～3 s倾斜试管1次,记录试管内出现凝胶状纤维蛋白，液面不动所需时间，并求出3支试管的均值。
2.4 大鼠体内凝血酶时间(thrombin time,TT)的测定［6］ 取内径1 cm的试管3支, 分别加入乏血小板血浆和Tris-HCl缓冲液各0.1 ml，混匀后置37℃育温2 min，再加入50 U/ml凝血酶0.1 ml，混匀。同时启动秒表，记录凝固时间，求出3支试管的均值。
2.5 大鼠体内活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)的测定［6］ 取内径1 cm试管3支，分别加入乏血小板血浆和白陶土脑磷脂的混悬液各0.1 ml，混匀，置37 ℃水浴温育3 min(其间轻轻摇荡数次)。加入0.025 mol/L CaCl2溶液0.1 ml，立刻启动秒表，轻轻倾斜并观察出现纤维蛋白丝的时间，求出3支试管均值。
2.6 大鼠体内血浆复钙时间(recalcification time,RT)的测定［6］ 取上述抗凝血1 ml，混匀后，以1 000 r/min离心10 min，分离富含血小板血浆，放入-70 ℃备用。取内径1 cm试管3支，分别加入血浆和生理盐水各0.1 ml，置于37 ℃水浴中1 min，加0.025 mol/L CaCl2溶液0.1 ml，混匀，同时启动秒表，1 min后每隔5 s缓慢倾斜试管1次，记录加入钙至纤维蛋白丝出现，液体不流动所需时间，求出3支试管平均值。
2.7 大鼠体内Fg含量的测定［6］
2.7.1 纤维蛋白制备 取3支10 ml的离心管，分别标记为B管、S管和U管，然后向U管加入待测血浆和12.5%Na2SO3溶液各0.5 ml，混匀后，置37 ℃水浴中10 min后，再以3 000 r/min离心30 min，倒掉上清液。取沉淀物，再加12.5% Na2SO3溶液5 ml，捣碎沉淀物，再次离心，倒掉上清液，将离心管内沉淀物倒置在滤纸上吸干。
2.7.2 纤维蛋白含量测定 取上述标记管并向S管加入0.05%Fg标准液0.05 ml，然后向各管加入生理盐水1 ml和双缩脲试剂4 ml，充分混匀后，置37 ℃水浴中15 min。在波长540 nm下紫外分光光度计比色，B管校正零点，读取S管和U管数值。计算公式： 血浆Fg含量(g/ml)=U×0.05×10/S。
2.8 大鼠血液黏度指标的测定 取上述抗凝血1.5 ml，用NXE-1B型椎板黏度计测定在不同切速下的全血比黏度。用液体石蜡校正仪器，检测温度25 ℃，所有样品在3 h内检测完。
2.9 大鼠血液生理指标的测定 大鼠断头时取0.2 ml血加入经肝素处理的采血管中混匀后，采用毛细管进样测血常规参数，包括红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、红细胞平均体积(MCV)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血小板平均体积(MPV)、RDW%、淋巴细胞比率(LYM%)、中值细胞比率(MID%)、中性粒细胞比率(GRAN%)、红细胞分布宽度(RDWa)、血小板分布宽度(PDW)、血小板占全血血小板数的百分比(LPCR)和血小板压积(PCT)。
2.10 大鼠肾上腺重量 大鼠断头取血后，立即采取大鼠两侧肾上腺(adrenal gland,AG)，并称其重量。
2.11 统计方法 数据处理采用SPSS11.5统计软件，多组间比较采用One-WayANOVA方差分析，两两比较采用LSD法。各组测定值以±s方法表示。
3 结果与分析
3.1 走马胎提取液对大鼠体内PT，TT，APTT，RT和AG的影响 表1结果表明，与生理盐水对照组相比较，病理模型组SD大鼠体内PT，APTT显著缩短(P<0.05)；与病理模型组相比较，PNS药物对照组和高剂量组SD大鼠体内PT，TT和APTT都极显著或显著延长(P<0.01或P<0.05)，中剂量组SD大鼠体内APTT显著延长(P<0.05)；与PNS药物对照组相比较，低剂量组SD大鼠体内PT，TT，APTT和RT差异显著(P<0.01或P<0.05)。
表1 走马胎提取液对大鼠体内PT，TT，APTT，RT和AG的影响（略）
与正常组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较，3)P<0.05，4)P<0.01；与PNS组比较，5)P<0.05，6)P<0.01 ；n=6
3.2 走马胎提取液对大鼠全血黏度和血浆Fg含量的影响 表2结果表明，与生理盐水对照组相比较，病理模型组SD大鼠血浆Fg含量、全血低切率(6 r/min和12 r/min)黏度显著升高(P<0.01，P<0.05)；与病理模型组相比较，PNS药物对照组和高剂量组SD大鼠血浆Fg含量显著降低(P<0.01或P<0.05)，PNS药物对照组和高中低剂量组SD大鼠全血低、中切率(6 r/min、12 r/min和30 r/min)黏度都显著下降(P<0.01或P<0.05)，PNS药物对照组高切率(60 r/min)黏度显著降低(P<0.05)，其他差异均不显著。
表2 走马胎提取液对大鼠全血黏度和血浆Fg含量的影响（略）
与正常组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较，3)P<0.05，4)P<0.01；与PNS组比较，5)P<0.05，6)P<0.01；n=6
3.3 走马胎提取液对大鼠血液生理指标的影响 表3结果表明，与生理盐水对照组相比，病理模型组SD大鼠的RBC，WBC，PLT，MCV，HGB，HCT，MCH，MCHC，MPV，RDW%，LYM%，GRAN%，RDWa，LPCR，PCT血液生理指标都有所升高，但差异不显著；与病理模型组相比较，低剂量组SD大鼠RDWa差异显著(P<0.05)，其余各组SD大鼠生理指标有所改善，但差异不显著。
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4 讨论
4.1 模拟疼痛紧张应激复制慢性动物血栓模型 血栓形成是一复杂的过程，其发生和发展与凝血系统、纤溶系统、血液流变学、血管内皮细胞、血小板聚集性等多种因素密切相关。随着社会竞争日益激烈，与应激有关的血栓性心血管疾病逐渐增多，因此治疗和预防血栓性疾病是一项艰巨而重要的任务。本文通过给大鼠皮下连续多次注射外源性小剂量肾上腺素, 使动物机体长期处于疼痛紧张刺激状态，模拟由于长期疼痛紧张应激反应所致机体内血栓形成。
本实验结果表明，与生理盐水对照组相比较，病理模型组SD大鼠凝血系统中PT和APTT都显著缩短，全血低切黏度和血浆Fg含量显著增高。这说明了实验动物长期处于疼痛紧张应激条件下，最终导致止血机制中的凝血因子过度激活，血液流变性异常的一种病理性结局。应激反应会刺激交感神经，导致儿茶酚胺类物质的大量释放，血小板容
易发生粘附和聚集，有发展为血栓的可能。此外，交感神经长期兴奋，以致较高的血压会持续地压迫血管，引起血管壁机械性损伤，胶原暴露。当血管呈持续压迫状态时，血管的内侧壁会产生血小板活性因子，损伤血管内皮细胞，激活凝血系统。这都为机体血栓形成提供了有利条件。
表3 走马胎提取液对大鼠血液生理指标的影响（略）
与正常组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较，3)P<0.05，4)P<0.01 ；与PNS组比较，5)P<0.05，6)P<0.01；n=6
4.2 走马胎提取液对动物凝血系统的作用 在机体凝血机制的检测中，APTT和TT用于检测机体内源性凝血系统的功能，其与凝血因子Ⅱ，Ⅴ，Ⅹ，Ⅺ，Ⅻ等浓度有关；而PT则是测定外源性凝血系统功能最常用的方法，与凝血因子Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，Ⅶ，Ⅹ的浓度及抗凝物质的存在有关［7］。所以临床上分别测定APTT，TT和PT来反映机体内、外源性凝血途径的状况，并通过APTT，TT和PT初步判断抗血栓药物的疗效。
本实验结果表明，与病理模型组相比，高剂量组SD大鼠体内PT，TT和APTT都显著延长，并呈现剂量-效应依赖关系(表1)。说明该物质对内源性和外源性凝血系统均有作用，其作用环节可能是抑制凝血酶原转变成凝血酶，进而抑制纤维蛋白原转变成纤维蛋白，影响凝血系统而发挥抗凝血作用。走马胎提取液高剂量组SD大鼠血浆中Fg的含量极显著降低，提示走马胎提取液可能有直接或/和间接降解血栓的作用。然而，走马胎提取液究竟作用于凝血系统的哪一个环节，作用于哪些凝血因子，通过何种方式降解血栓，其抗凝血药理作用机制如何，目前仍不清楚，尚需作进一步研究。
4.3 走马胎提取液对动物血液流变学的作用 全血黏滞性主要是由红细胞聚集性和变形性等因素所决定。红细胞聚集性越大，全血低切黏度越大；红细胞变形能力越差，全血高切黏度越大。本实验结果表明，与病理模型组相比，走马胎提取液高、中、低剂量组全血低切率(6 r/min和12 r/min)黏度极显著降低(见表2)，全血中高切率黏度和血液生理指标都有所改善，但差异不显著(见表2~3)。说明走马胎提取液有降低全血低、中、高切率黏度的作用，且对低切率黏度的降低明显强于高切率黏度，这可能与走马胎提取液主要是通过降低红细胞的聚集性和增强红细胞的变形能力以降低全血黏度，而不是通过改变血液生理指标来改善血液流变性有关。
Fg是由肝脏合成的一种可溶性血浆糖蛋白，是血浆和血液黏稠度的主要决定因素，也是机体重要的凝血因子之一。一方面，Fg在凝血酶的作用下转化成不可溶的纤维蛋白沉积于血管壁，同时还能特异性的与血小板微粒中血小板膜糖蛋白(glycoprotein，Gp)Ⅱb/Ⅲa复合体相结合，从而激活GpⅡb/Ⅲa复合体；活化的GpⅡb-Ⅲa复合体可通过膜受体(GpⅡb-Ⅲa)-连接蛋白(Fg)-调节蛋白(血小板反应素或者是Fg和血管性假性血友病因子)-膜受体(GpⅡb-Ⅲa)桥联方式使血小板发生黏附聚集，并结合可溶性和不溶性Fg，从而产生强烈的促凝血作用［8］。大分子Fg及纤维蛋白的桥联作用提高血液黏性，进一步增加了血栓形成的危险性［9］。另一方面，增多的Fg还能够掩盖红细胞表面电荷，使红细胞膜表面电荷减弱，静电排斥力降低，促使红细胞互相之间发生凝集，从而增加了全血黏滞性； Fg黏附特性也可能促进红细胞变形性的下降［10］。本实验结果表明，与病理模型组相比较，走马胎提取液高剂量组SD大鼠血浆Fg含量显著降低。说明走马胎提取液可通过降解Fg，减少血小板发生黏附聚集，使血液黏稠度降低。
综上所述，走马胎提取液具有活血化淤，改善血液流变学特性，抑制血栓形成的作用，这为临床预防及治疗血栓性心血管疾病提供了药理学理论基础。因此，走马胎抗血栓作用机制值得进一步研究。
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