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作者：张学武 崔长旭 陈丽艳 全吉淑
【摘要】 目的观察黄芩苷对肝癌HepG-2细胞增殖的影响。方法采用MTT比色法观察黄芩苷抑制肝癌HepG-2细胞增殖；采用流式细胞仪检测黄芩苷对HepG-2细胞周期分布的影响。结果黄芩苷可抑制肝癌HepG-2细胞增殖，其作用具有时间和浓度依赖性；黄芩苷可诱导细胞凋亡，同时改变细胞周期分布，多数细胞阻滞于S期，与对照组比较，细胞凋亡率差异有显著性。结论黄芩苷可诱导肝癌HepG-2细胞凋亡，改变细胞周期分布，从而抑制细胞增殖。
【关键词】 黄芩苷 细胞周期 细胞凋亡
Abstract:ObjectiveTo investigate the inhibition of baicalin on proliferation hepatoma HepG-2 cells. MethodsMTT assay was used to examine the effect of baicalin on the proliferation of HepG-2 cell and flow cytometry was used for the cell cycle distribution.ResultsBaicalin inhibited the proliferation of HepG-2 cell and the effects were in a time-and-concentration dependent manner. Baicalin could also induce apoptosis, the S phase was arrested and the ratio of apoptosis there was significant difference than that of control group, respectively. ConclusionBaicalin inhibits proliferation of HepG-2 cells via induction of apoptosis and cell cycle arrest.
Key words:Baicalin; Cell cycle; Apoptosis
黄芩为唇形科(Labiatae)植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，是常用中药。论文学术科研网性寒、味苦，归肺、心、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。黄芩的主要成分是黄酮和黄酮醇、二氢黄酮和二氢黄酮醇、苯乙醇糖苷、挥发油以及葡萄糖、蔗糖、苯甲酸、β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和苯甲醇等。其中，属于黄酮类化合物的黄芩苷(Baicalin)作为黄芩的最主要有效成分，在黄芩根中含量为9%~14%。近年来，随着对黄芩苷的深入研究，发现黄芩苷具有抗菌、抗病毒、抗感染、抗HIV、抗氧化及清除氧自由基和治疗心血管疾病等作用。本实验选用肝癌HepG-2细胞株作为研究对象，研究黄芩苷对肝癌HepG-2细胞增殖的作用以及黄芩苷对细胞周期分布和凋亡的影响。
1 材料与仪器
1.1 细胞株HepG-2细胞购于南京凯基生物技术公司。
1.2 药物试剂黄芩苷购于南京青泽医药有限公司。噻唑兰购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；小牛血清购自北京华美生物工程公司；胰蛋白酶购自美国DIFCO公司；鼠抗bcl-2、p53单克隆抗体购自福州迈新生物有限公司。
1.3 仪器OLYMPUS倒置显微镜购自日本；RT-2100型酶标仪购自美国；FACS Calibur流式细胞仪购自美国；JEM-1200EX透射电子显微镜购自日本；PD-2000真彩色病理细胞图像分析仪购自北京天地百年科技公司。
2 方法
2.1 HepG-2细胞培养肝癌HepG-2细胞贴壁生长，培养于含10%灭活小牛血清，含100 U/ml 青霉素及100 U/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃、相对湿度90%、5% CO2孵箱内培养。
2.2 HepG-2细胞形态的变化取对数生长期HepG-2细胞按每瓶1×105个细胞接种于96孔细胞培养板中，24 h后换液，加入含不同浓度（25，50，100 μg/ml）黄芩苷的10%新生小牛血清RPMI 1640 培养液200 μl，另设终浓度为25 μg/ml 5-Fu的阳性对照组和不加药物的阴性对照组。置5% CO2孵箱内培养24,48，72 h。每天在倒置显微镜下观察细胞生 生长状态，48 h时进行常规HE染色。
2.3 MTT比色实验取对数生长期的HepG-2细胞按每孔1×105 个细胞接种于96孔板中，每孔体积200 μl。24 h后换液，黄芩苷组加入黄芩苷使其终浓度分别为25，50，100 μg/ml，另设终浓度为25 μg/ml 的5-Fu阳性对照组和不加药物的阴性对照组以及不接种细胞的空白对照组。分别培养24，48，72 h，每个浓度每个时点均设4个复孔。于终止前4 h，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，继续孵育4 h后弃去上清液，加入150 μl DMSO，轻轻振荡10 min，使结晶物完全溶解，于490 nm波长处在荧光酶联分析仪上测光吸收值(A值)，计算抑制率(IR)。
IR(%)=(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值×100%
2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布对照组和50 μg/ml黄芩苷组细胞培养48 h后，收集各组细胞悬液1 ml，浓度约为106个/ml，离心（1 000 r/min, 5 min），弃掉培养液，70%冷乙醇固定，4℃PI暗染30 min，流式细胞仪检测，采用 ModfitLT3.0 软件对各组样本进行DNA含量及细胞周期分析。
2.5 统计方法应用SPSS11.5统计软件进行相关性分析和方差分析，数据采用±s表示。
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3 结果
3.1 对HepG-2细胞生长的影响
3.1.1 细胞生长形态变化对照组HepG-2细胞呈上皮型贴壁生长，细胞呈延展、扁平，细胞均质而透明，细胞一般有2~4个核仁，核膜、核仁轮廓明显，细胞间结构紧密，细胞生长旺盛。黄芩苷组、阳性对照组细胞轮廓增强、反差增大，变圆浮起，细胞间接触变松，增殖减慢，胞质中颗粒增多；HE染色染色质浓缩，呈深染的新月体形，可见凋亡小体。
3.1.2 MTT比色实验不同浓度处理组分别培养24，48 h，黄芩苷对HepG-2细胞生长有抑制作用，且其抑制作用具有时间和浓度依赖性。随着时间的延长和药物浓度的增加，细胞抑制效果越明显，药物对肿瘤细胞生长有量-效、时-效关系。当黄芩苷浓度为50 μg/ml作用时间为48 h时，对HepG-2细胞的抑制率为51.241%，接近半数抑制浓度(IC50)。结果见表1~2。
表1 黄芩苷对HepG-2细胞生长的影响（略）
表2 黄芩苷对HepG-2细胞生长抑制率（略）
与同剂量组比较，*P<0.01；与同时间组比较，ΔP< 0.01
3.2 黄芩苷对 HepG-2细胞DNA含量的影响50 μg/ml黄芩苷作用于HepG-2细胞48 h后，经流式细胞仪检测（图1）可以看出加药组细胞出现明显的细胞凋亡峰，其凋亡率为 27.01%，与对照组细胞的凋亡率5.47%相比差异有显著性（P＜0.01）。结果见表3。
图1 黄芩苷对HepG-2细胞DNA含量的影响(FCM)（略）
3.3 黄芩苷对HepG-2细胞周期的作用经流式细胞仪分析，50 μg/ml黄芩苷处理HepG-2细胞48 h后，在 G0/G1 期、G2/M和S期的细胞分别为56.49%，11.02%和 32.49%；而未经药物作用的对照组细胞的G0/G1期为54.79%、G2/M期为22.11%、S期为23.10%。可见黄芩苷作用下，G2/M期细胞明显减少，而S期细胞比率显著上升，多数细胞阻滞在S期。结果见表3。
表3 黄芩苷对HepG-2细胞周期的影响（略）
与对照组比较，*P<0.01
4 讨论
细胞凋亡普遍存在于大多数肿瘤组织细胞中，与肿瘤的发生、发展及退化有密切的关系［1］。现已明确，大多数抗肿瘤药物都能诱导敏感肿瘤细胞发生凋亡，并且其抗肿瘤效能与肿瘤细胞在药物诱导下发生细胞凋亡的内在活性有关［2］。因此，通过观察是否能诱导肿瘤细胞凋亡已成为寻找抗肿瘤药物的新靶点，也是评价疗效的一项新指标［3］。本实验中MTT结果显示黄芩苷对HepG-2细胞的增殖具有明显的抑制作用。其细胞生长抑制随着药物浓度的升高和时间的延长而增加，具有量-效、时-效关系。流式细胞术结果说明黄芩苷可以诱导肝癌HepG-2细胞凋亡。同时，黄芩苷能明显抑制HepG-2细胞的周期变化，使其阻滞细胞停止于S 期，使细胞周期改变而诱导细胞凋亡。关于黄芩苷诱导细胞凋亡的详细作用机制有待于进一步研究。
【参考文献】
［1］ 黄韧敏，袁淑兰.丹参酮ⅡA诱导HL-60细胞凋亡［
J］.癌症，1998，17(3)：164.
［2］ 李 英，徐功立，李 颖,等．鸦胆子油乳诱导白血病U937细胞凋亡的实验研究［J］.中华血液学杂志，2004，25(6):381.
［3］ 姚保泰，吴 敏,王 博．盐酸小檗碱抑制实验性大鼠胃癌前病变细胞bcl-2表达作用的研究［J］.中国中医药杂志，2005，20(3)：186.