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作者：李翠 徐必学 张永萍 梁光义
【摘要】 目的改进2005年版《中国药典》Ⅰ部甘草项下甘草苷的含量测定方法。方法对甘草中甘草苷的提取方法进行了正交优选，并与药典方法进行了比较。结果最佳提取方法为用药材250倍体积的0.3%氨水，80℃水浴回流30 min，含量测定结果高于2005年版《中国药典》Ⅰ部项下甘草中甘草苷测定方法30%～50%。结论该方法能够准确地测定甘草中甘草苷的含量。
【关键词】 甘草 甘草苷 含量测定 正交实验
甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch．，胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat．或光果甘草Glycyrrhiza glabra L．的干燥根及根茎，有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效［1］。论文学术科研网甘草苷作为甘草中的主要有效成分之一，2005年版《中国药典》（简称药典）新增了其HPLC含量测定方法。作者在实验中发现回流法提取甘草苷的提得率明显高于2005年版药典中采取的超声法，因此本研究对甘草苷含量测定前样品提取方法进行了正交优选，建立了其相对稳定可靠的含测方法。
1 仪器与材料
1.1 仪器岛津LC-6AD高效液相色谱系统（岛津公司），TDA-8002电热恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂），KQ300DA型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试药甘草苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号111610-200503)；乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯；甘草分别购于北京同仁堂贵阳分店、贵阳海健医药有限公司，经贵阳中医学院王世清教授鉴定，粉碎（过三号筛)，备用。
2 方法与结果
2.1 色谱分析条件色谱柱为HP hypersil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) ；流动相为乙腈-0.1%醋酸（20∶80）；流速0.8 ml?min-1；检测波长276 nm；柱温为室温；进样体积10 μl。对照品及样品分离的色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备 取甘草苷对照品5 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
2.3 提取方法的选择 取同一甘草粉末约0.2 g（6份），精密称定，分别置于6个50 ml具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇10 ml，称定重量，2份直接超声30 min（2005年版药典方法），2份浸泡12 h后超声30 min，2份水浴回流30 min，放冷，补足重量，静置。取上清液1 ml，置5 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按上述色谱条件进行测定，含量分别为0.84%，0.84%，0.91%，结果显示水浴回流提取效率最高。
图1 对照品及甘草样品的HPLC图（略）
2.4 提取溶剂的选择取同一甘草粉末约0.2 g（4份），精密称定，置100 ml圆底烧瓶中，分别加入甲醇、70%乙醇、0.5%氨水和70%乙醇（含0.5??氨）各10 ml，称定重量，80℃水浴回流2 h，取出放冷，补足重量，摇匀，静置。取上清液1 ml，置5 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度。检测方法同上。结果见表1。
表1 提取溶剂的考察（略）
由表1可以看出，0.5%氨水提取效率最高，故选择氨水作为提取溶剂。
2.5 正交实验结果及分析［2］根据初步实验，本文采用氨水浓度（%）、溶剂体积（倍）、回流时间（h）及水浴温度（℃）为考察因素，选用L9 (34) 正交表安排实验(重复实验2次) 。结果见表2～4。
表2 因素水平（略）
对实验结果进行直观分析，可以得出影响甘草苷提取的因素作用主次为B>D>C>A，方差分析显示因素B 有显著影响。通过综合分析，优化后的最佳条件为A2B3C1D2，即用药材250倍体积的0.3%氨水，80℃水浴回流0.5 h。
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2.6 线性关系的考察 精密量取上述对照品溶液适量，配制成系列浓度的对照品溶液2.58，5.17，12.93，25.85，51.70，72.38，93.06 μg?ml-1。按上述色谱条件测定甘草苷峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），对照品浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，Y=309 223 26.863 7X+296 30.780 6，r=0.999 9。结果表明，甘草苷在0.025 8 ～0.930 6 μg线性关系良好。
表3 实验结果（略）
> 表4 方差分析（略）
2.7 精密度实验 精密吸取同一对照品溶液(11.76 μg?ml-1)10 μl，重复进样5次，记录色谱图，以峰面积计算，其RSD为1.15%。
2.8 重复性实验 精密称取同一甘草粉末样品（6份），按上述方法提取、测定，甘草苷平均含量1.22%，RSD=1.21%。
2.9 加样回收实验 取甘草粉末约0.2 g(9份)，精密称定，按高、中、低量分别加入甘草苷对照品，再加入0.3%氨水50 ml，按照优化条件提取、制备样品，然后按甘草苷含量测定方法测定含量，计算回收率。结果见表5。
表5 回收率测定结果（略）
2.10 样品含量测定 取不同产地批号甘草，按照2005年版《中国药典》方法和本实验已优选出方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，并计算含量。结果见表6。
表6 样品测定结果（略）
3 讨论
方差分析显示氨水用量对结果有显著性的影响，本实验另外考察了500倍溶剂体积提取，同批甘草含量测定结果为1.23%，与250倍提取体积无明显差异，故最终确定250倍作为最佳溶剂用量。
表5的实验数据显示，2005年版《中国药典》甘草项下甘草苷含量测定方法得到的结果均显著低于本实验方法得到的结果，说明2005年版《中国药典》甘草项下对甘草苷含量测定的提取不完全，建议再版时考虑改进，本实验为更客观地评价甘草药材的质量提供了一种含量测定的参考方法。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：59.
［2］ 刘明芝.中医药统计学［M］.长沙：湖南科学技术出版社，1999：299.