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【摘要】 目的观察中药牛膝提取物神经再生素(NRF)对小鼠损伤坐骨神经的修复作用。方法ICR小鼠50只，雌雄各半，行坐骨神经夹伤术，随机分成5组：NRF高、中、低剂量组，弥可保组（阳性对照），生理盐水组（空白对照）。术后每日腹腔注射给药。采用小鼠坐骨神经功能指数(sciatic function index, SFI)、组织形态学及电镜检查，观察NRF对损伤坐骨神经的影响。结果与空白对照组相比，NRF可显著改善小鼠的坐骨神经功能。论文学术科研网超微结构观察表明，实验组有髓神经纤维的髓鞘形态、厚度、成熟度均优于对照组，而变性纤维的数目少于对照组。结论NRF能促进小鼠坐骨神经损伤后的修复及其功能的恢复。
【关键词】 牛膝； 神经再生素； 坐骨神经损伤； 神经再生
Abstract：ObjectiveTo investigate the repair effect of nerve regeneration factor（NRF）extracted from Achyranthes bidentata Blume (BL) on the crushed sciatic nerve of mouse. MethodsFifty ICR mice suffered from the sciatic nerves crush were used in the experiment. The animals were randomly divided into five groups: three NRF groups (low, middle and high dose), Mecobalamin group (positive control) and blank control group. These mice after sciatic nerves crush received NRF by intraperitoneal injection every day. Sciatic function index (SFI) was tested every 4 days. Histomorphology and ultra-structure were used to the study on the 21th day. ResultsCompared with the black control group, SFI in NRF group and the section area of the gastrocnemius muscle were larger. The number of regeneration nerve fibers, thick and degree of maturity of regeneration myelinated nerve sheath in NRF groups were more than those in the blank control group. ConclusionNRF can promote the regeneration of peripheral nerve and improve the recovery of function.
Key words：Achyranthes bidentata Blume (BL)； Nerve regeneration factor； Sciatic nerve injury； Nerve regeneration
神经再生素（nerve regeneration factor, NRF）是从中药怀牛膝中提取的有效组分（中国专利申请号:200710019780.4），主要成分为甾酮、多糖、多肽等。已有的研究资料显示，神经再生素具有促进神经元生长、防止神经元凋亡的作用［1～6］。本实验采用小鼠坐骨神经损伤模型，观察NRF对周围神经损伤的修复作用，进一步探讨其药理作用。
1 材料与方法
1.1 动物和试剂 健康成年ICR小鼠50只(由南通大学动物中心提供)，体重（20±2）g，雌雄各半，随机分成5组。NRF由南通大学神经再生重点实验室提供（批号：060213），注射用生理盐水溶解至适当浓度备用。弥可保注射液：日本卫材株式会社制造（批号：050665）。
1.2 模型制备 复合麻醉剂（0.03 ml/10 g）作腹腔麻醉，左臀部作1 cm切口，在距梨状肌下缘0.3 cm处以特制钳子，钳夹坐骨神经3次，10 s/次，间隙10 s，挤压损伤的宽度为2 mm。损伤远端以8-0显微缝线 线在神经外膜上作标记，缝合切口。术后每天腹腔注射给药：NRF高、中、低剂量组（0.16，0.08，0.04 mg/10 g体重），弥可保组（1.3 μg/10 g体重，按体表面积折算相当于临床人推荐剂量），空白对照组（给予等体积生理盐水）。
1.3 一般情况观察 术后每天观察小鼠伤口愈合情况、步态变化及整体状态。
1.4 坐骨神经功能指数(sciatic nerve index, SFI)测定 术后8，12，16，20 d分别行足迹实验。小鼠双侧后足蘸红色印泥行走后每侧足留下8～10个足印，测量足印长度（print length,PL）、足趾宽度（toe spread,TS）、中间足趾宽度（intermediary toe spread,IT），将上述3个变量代入Bain公式计算出坐骨神经功能指数（sciatic function index, SFI）：SFI=-38.3（EPL-NPL）/NPL+109.5（ETS-NTS）/NTS+13.3（EIT-NIT）/NIT-8.8。公式中各变量前E代表术侧，N代表健侧。SFI以0为正常值，-100为神经完全断离的指标［7］。
1.5 腓肠肌肌细胞截面积测量 术后21 d，各组小鼠经生理盐水和4%多聚甲醛灌注内固定，取术侧腓肠肌标本，浸入4%多聚甲醛后固定。流水冲洗24 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，厚度为5 μm，常规HE染色。40×显微镜下观察横切片，随机选取6个高倍视野，每个视野计数30个肌细胞，利用Leica Qwin图象分析系统测量肌细胞截面积，求平均值。
1.6 电镜检查 术后21 d时，每组随机抽取2只小鼠，取夹伤远端的坐骨神经约3 mm，戊二醛固定，Epon812环氧树脂包埋，半薄切片定位，超薄（3 nm）切片，铀-铅复染，透射电镜观察。
1.7 统计分析 本实验为成组设计，使用Stata8.0统计软件进行分析。数值资料采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，进一步则用Scheffe法进行两两比较。P＜0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大体状况 术后所有小鼠均顺利苏醒，实验侧后肢拖地行走，未见切口感染，精神状态良好、毛色光亮。
2.2 SFI测定 各组SFI的数值均随着时间的延长而逐渐升高。术后12 d，NRF中、高剂量组小鼠SFI明显优于空白对照组（P＜0.05或P＜0.01）；术后16 d，NRF低、中、高剂量组小鼠SFI亦明显优于空白对照组（P＜0.0 5或P＜0.01）；术后20 d，NRF低、中、高剂量组均明显优于空白对照组（P＜0.01）。结果见表1。
表1 NRF对坐骨神经损伤小鼠SFI的影响（略）
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；n=10
2.3 腓肠肌肌细胞截面积测量利用Leica Qwin图象分析系统测量肌细胞截面积。结果表明，术后21 d,NRF组小鼠腓肠肌细胞截面积随着用药剂量的增加而随之增加，其中NRF高剂量组明显优于空白对照组（P＜0.05）结果见表2。 光镜结果显示，NRF高剂量组和弥可保组腓肠肌肌细胞饱满且排列整齐，空白对照组腓肠肌肌细胞排列欠整齐,结果见图1。
表2 腓肠肌细胞截面积（略）
与空白对照组相比较，*P＜0.05；n=10
a-NRF高剂量组, 肌细胞饱满整齐 b-弥可保组, 肌细胞饱满整齐 c-空白对照组，肌细胞排列欠整齐
图1 术后21 d坐骨神经损伤小鼠腓肠肌横切（HE染色，Bar=20 μm）（略）
2.4 电镜观察结果结果显示，NRF高剂量组和弥可保组再生神经横切面可见板层结构较成熟、排列致密的有髓纤维髓鞘较厚，变性纤维较少;而空白对照组再生的有髓神经纤维排列稀疏，髓鞘较薄，板层结构成熟度欠佳。结果见图2。
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3 讨论
NRF是从中药怀牛膝提取的有效组分，以往的研究表明NRF作用于体外培养的神经细胞，使神经生长相关基因表达上调［1］，能促进体外培养背根神经节神经突起的生长和GAP-43、NF-H的表达［2］，对大鼠坐骨神经损伤后的修复有明显的促进作用及对受损的神经元亦有保护作用［3］，能促进大脑皮层神经元存活的作用［4］，还可以通过抑制Caspases-3基因表达和活化，发挥其抗凋亡作用［5］，能活化ERK1/2信号通路而诱导PC12细胞的神经元性分化［6］，NRF还可改善神经髓鞘功能，有效提高糖尿病
周围神经病变大鼠坐骨神经的感觉神经传导速度［8］。
为进一步探讨NRF对外周神经再生的影响，本研究采用小鼠坐骨神经夹伤模型，通过测定小鼠的坐骨神经功能指数（SFI）及图象分析系统测量腓肠肌肌细胞截面积及超微结构观察有髓神经纤维的髓鞘形态、厚度、成熟度的分析，观察NRF对小鼠坐骨神经功能恢复情况。
图2 术后21 d，坐骨神经损伤小鼠再生神经横切（铀-铅复染，Bar=2μm）（略）
既往有学者研究证明［9］，SFI评价坐骨神经再生及功能恢复是完全可靠的，与肌力、神经电生理及组织形态学各项指标呈正相关，除了反映下肢肌张力恢复的情况外，还可以反映下肢各肌肉的协调功能，是值得推广的神经功能评价方法。因此本实验采用SFI作为评价坐骨神经功能恢复的指标，数据统计分析的结果显示：NRF可以促进坐骨神经夹伤后的修复，表现为改善其坐骨神经功能，且各组之间存在一定的剂量反应关系。
神经对其靶肌肉的营养和支配作用，主要是通过神经末梢释放的神经递质，持续性调节支配肌肉的活动，从而影响其生理功能。神经损伤后，失神经支配的靶肌肉将会出现肌肉萎缩、功能障碍。只有再生的轴突与靶肌肉之间建立了功能联系，才能使靶肌肉恢复形态和功能［10］。有资料表明，周围神经损伤后，肌细胞直径及截面积随失神经支配时间的延长呈进行性下降，是肌肉萎缩的可靠形态学指标［11］。研究表明，肌细胞截面积的减少是骨骼肌失神经支配后最为显著的表现之一，也是国内外学者研究失神经肌萎缩最常用的指标。因此，本实验采用腓肠肌肌细胞截面积观察失去坐骨神经支配后的腓肠肌的形态，了解神经再生的情况。结果显示，NRF组小鼠腓肠肌肌截面积都大于空白对照组。随着用药剂量的增加，肌细胞截面积也随之增加，其中NRF高剂量组明显优于空白对照组，提示NRF能促进神经再生及其功能的恢复，从而减轻神经损伤后的肌肉萎缩。
周围神经损伤后肢体软弱、筋脉弛纵、肌肉萎缩属中医“痿证”“瘫痪”范畴。本实验采用的NRF是中药怀牛膝提取物，而怀牛膝为苋科多年生草本植物牛膝(Achyranthes bidentata Blume,BL)的根，具有补肝肾、强筋骨、活血通经之功效［12］。此外，NRF还具有水溶性高、毒副作用极低的特点，可有效地改善损伤神经的功能、促进周围神经再生，显示出该药具有潜在的开发应用前景，为NRF应用于临床治疗神经损伤、防治神经退行性变疾病提供了实验依据。
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