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作者：李秋红，李廷利，黄莉莉，李飞
【摘要】 综述了中药抗氧化作用的可能机理和中药抗氧化作用的评价方法；重点介绍了二苯代苦味酰基自由基(DPPH)法、硫代巴比妥酸（TBA）法、Fe3+还原/抗氧化能力（FRAP）法和生物化学发光法4种目前常用的中药抗氧化作用评价方法及采用这些方法所取得的研究结果。
【关键词】 中药； 抗氧化作用； 机理； 评价方法
Abstract:This article overviews the possible mechanism of antioxidation and the evaluation method of Chinese medicine;Four kinds of frequently used evauation methods for Chinese medicine at present are introduced mainly in this article,including DPPH,TBA,FRAP and biochemilemine scence.Some research results using these methods are also introduced.
Key words:Chinese medicine; Antioxident activity; Mechanism; Evaluation method
衰老的自由基(free radical)学说是英国的Harman于1956年最早提出的，该学说认为自由基攻击生命大分子造成组织损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要原因［1］。近年来，新的抗氧化机制不断被发现，人们越来越趋向于应用天然抗氧化剂，我国有丰富的中草药资源，它们的药效和安全性比较明确。许多学者认为某些中草药的疗效与其抗氧化作用密切相关。已发现的植物药抗氧化成分有黄酮类、皂苷类、多糖类、有机酸类、萜烯等，这些物质通过清除人体内自由基，还原氧化物质，从而达到保护机体的作用［2］。论文学术科研网因此，从中草药中筛选具有抗氧化和清除自由基活性的物质，对食品和医药工业均有重要意义，可为今后系统研究植物药抗氧化活性奠定基础。
1 中药抗氧化作用的可能机理
目前认为中药成分对机体氧化损伤的保护作用主要包括以下几方面:
1.1 直接清除活性氧自由基自由基又叫游离基,活性氧自由基是一些处于激发态的含氧基团,如超氧阴离子自由基、羟基自由基、烷氧基自由基等。?ＯＨ是化学性质最活泼的活性氧，它带有一个不成对电子，是对人体毒性最大的自由基，它可以与活细胞中的任何分子发生反应而造成损害，而且反应速度极快。Ｏ-2?是自由基引起机体中毒的主要原因，可使核酸链断裂、多糖解聚和不饱和脂肪酸过氧化，进而造成膜损伤、线粒体氧化磷酸化等影响。目前制备超氧阴离子自由基的经典方法是邻苯三酚自氧化法。如陈玫等［3］采用连苯三酚自氧化法,研究浙贝母、茵陈等8种中药不同提取物的抗氧化活性。结果表明,其中7种中药都可抑制连苯三酚自氧化,清除超氧阴离子自由基。
1.2 增强抗氧化酶活性细胞在生命活动过程内不断地产生自由基，机体的抗氧化酶通过一系列的催化反应将其转化为O2和CO2。细胞中的主要抗氧化酶是超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）。SOD是含有Cu，Zn，Mn，Fe等金属离子，是体内超氧阴离子的主要清除者，将其催化分解为H2O2，H2O2也具有氧化损伤作用，通过过氧化氢酶将其转化为O2和H2O。同时H2O2也可通过GSH-Px的催化和还原型谷胱甘肽（GSH）反应生成H2O,同时生成还原型谷胱甘肽［4］。如槲皮素能减少胰岛β细胞的氧化损伤，同时还能恢复Fe2+致肾细胞损伤动物的SOD， GSH-Px和过氧化氢酶的活力［5］。李波等研究表明杨梅素芸香苷对氧化损伤性原代培养大鼠肝细胞具有明显保护作用，其保护作用机理是直接清除氧自由基，增加原代培养肝细胞内抗氧化酶SOD和GSH-Px的活力。
1.3 抗脂质过氧化，维持细胞膜稳定性细胞中自由基对细胞的直接损伤作用主要是攻击细胞膜上的脂质，自由基先和细胞膜上的磷脂或低密度脂蛋白（LDL）的不饱和脂肪酸反应，该反应产物又攻击附近的不饱和脂肪酸，最终导致链式反应的产生。过氧化程度多以其最终产物中丙二醛（MDA）为评价指标［6］。近来有研究认为，部分黄酮类化合物以氢键形式与细胞膜结合，保护细胞膜上的不饱和键不与自由基接触，抗脂质过氧化［7］。
1.4 减少DNA损伤自由基学说认为，过剩 剩的自由基可以攻击DNA，引起DNA损伤，从而引发多种疾病。对中药抗氧化作用的研究目前在某些方面已深入到 DNA分子水平［8］。
1.5 对氧化酶系活力及表达的影响如对黄嘌呤氧化酶（XO）的影响。XO可将黄嘌呤催化生成尿酸盐，同时产生超氧阴离子。该过程是缺血/再灌注损伤的一个非常重要的途径。在机体正常生理状态下，该酶以黄嘌呤脱氢酶形式存在，在机体处于缺血状态时，黄嘌呤脱氢酶转化为XO，当缺血组织再灌注时，XO催化产生超氧阴离子，导致氧化损伤。因此黄嘌呤氧化酶的含量可作为抗氧化研究的指标成分（2005浙江大学硕士论文《八种中药豆类荚果乙醇提取物及所含杨梅树芸香苷抗氧化作用研究》）。
另外,对一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶的影响。正常生理状态下，NO在舒张血管内皮、维持机体血压平衡方面起重要作用。但高浓度却能和活性氧反应后产生氧化能?更高的亚硝基自由基，同时NO也可看作是一种自由基，导致细胞氧化损伤。在缺血再灌注损伤时，NO主要合成酶，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性增加，大量NO产生而导致氧化损伤形成［9］。研究发现许多黄酮类化合物包括槲皮素、姜黄素在缺血再灌注损伤时可抑制iNOS的活性，而起到抗氧化作用［10］。
2 中药抗氧化活性的评价方法
中药抗氧化活性的评价方法随着科学技术的发展和设备的更新而不断地发展和改变。一些过程繁琐，准确性不高的评价方法逐渐被淘汰，下面重点介绍一些近年来出现的中药抗氧化活性评价方法。
2.1 二苯代苦味酰基自由基（DPPH）法1958 年, Blois首次将DPPH法应用于抗氧化剂的筛选研究，近年来该方法在抗氧化剂研究中受到普遍重视，它克服了传统方法的一些缺陷，具有快速、简便、灵敏、易检测和直接可行的优点，被广泛用于抗氧化剂的研究，DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有3 个苯环，1 个氮原子上有1个孤对电子，其溶液呈深紫色，在517 nm有强吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH?的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学剂量关系，从而用于评价实验样品的抗氧化能力。该反应必须在避光条件下进行，另外反应体系的pH值应调至7.4 左右，最好在缓冲液体系中进行。柳艳等［11］利用自由基反应模型观察丹酚酸B对DPPH自由基的淬灭效应，并结合高效液相色谱(HPLC)技术分别研究温度和pH值对丹酚酸B清除DPPH能力的影响。为丹酚酸B抗氧化能力的另一作用途径及其影响因素的研究提供依据。胡博路等［12］采用DPPH法测定30 种中草药乙醇提取液中的抗氧化活性。结果表明五倍子、诃子、大黄、槐花米等9种中药具有很强的抗氧化活性。康文艺等［13］采用DPPH自由基体系对茜草提取部位进行抗氧化筛选。结果从有活性的氯仿部位分离得到11个化合物,其中3个化合物具有抗氧化活性。
2.2 硫代巴比妥酸（TBA）法TBA法是测量脂肪酸，细胞膜和生物组织脂质过氧化的最古老也是应用最多的方法，它还是最容易应用于粗提生物体系的方法，氧化的油脂多生成丙二醛，一分子的丙二醛可同两分子的硫代巴比妥酸（TBA）作用生成有色化合物，该有色化合物在吸光度530 nm左右有吸收。因此，可通过测定丙二醛的量来评价油脂的氧化程度。夏晓凯等［14］通过TBA法测定大鼠肝匀浆自发和诱导的脂质过氧化产物MDA含量，研究黄精多糖(PSP)体外抗氧化作用。邓胜国等［15］采用ＴＢＡ法测定和评价荷叶黄酮的抗氧化效果。结果表明荷叶黄酮具有良好的清除自由基能力，能有效抑制亚油酸的氧化。
2.3 Fe3+还原/抗氧化能力（FRAP）法FRAP法原理为在较低pＨ环境下，Fe3+－三吡啶三吖嗪（tripyridyl-triazine, TPTZ）可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于吸光度593 nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性强弱［16］。吴青等［17］采用Folin-Ciocalteu方法测定15 种中草药不同提取物总酚含量；用ＤＰＰＨ和ＦＲＡＰ法评估了不同提取物的抗氧化活性。结果表明大花紫薇叶的抗氧化活性最高，其甲醇提取物中酚类物质的含量最高。李云峰等(2004军事医学科学院博士论文《石榴皮抗氧化物质提取及其抗氧化抗动脉粥样硬化作用研究》）以FRAP值为评价指标，按正交设计原则，确定了石榴皮抗氧化物质提取的最佳溶剂和提取条件。另采用细胞培养的方法研究石榴皮提取物抗氧化能力，结果显示石榴皮提取物能够提高氧化损伤VEC(Ox-LDL,诱导)的细胞活力，提高细胞抗氧化防御功能。
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2.4 生物化学发光法清
除氧自由基能力评价生物化学发光法测定氧自由基清除作用时，一定浓度范围内发光强度(CL)与氧自由基数量呈量效关系。清除氧自由基的物质则可以降低CL，根据CL的下降则可以判断某物质清除氧自由基的能力［18］。流动注射化学发光技术是一种简单、快速和灵敏度高的方法，可对药物和植物性食物中活性成分含量及抗氧化性进行测定。刘泽敏等［19］采用反相流动注射化学发光法研究了旱芹、西芹的抗氧化性。实验结果表明旱芹和西芹提取液均能有效抑制超氧自由基诱导的鲁米诺化学发光，并随着发光体系中提取液浓度的增大，发光强度呈现下降趋势，且具有较强的抗氧化性，并对旱芹和西芹抗氧化性能进行了比较。吴拥军等［20］采用Lumino-Ｈ2Ｏ2-Ｃｕ2+化学发光法测定巴戟天提取液的抗氧化活性,同时采用分光光度法分别测定了其对超氧阴离子自由基和羟基自由基的抑制率。该方法灵敏度高、快速测定、操作简单和重复性好,因此可用于抗自由基活性药物的筛选。
3 讨论
由于生物抗氧化剂在体内外的作用非常复杂，尽管一种抗氧化剂在某一种抗氧化体系中抗氧化效果好，但在另一种体系中效果不一定好，故应该建立一套多方案评价体系来评价中药的抗氧化能力，因此中药抗氧化作用研究还有大量工作要完成。
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