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作者：周颖 李桥 方颖 刘焱文
【摘要】 目的建立超临界二氧化碳萃取缬草油的指纹图谱分析方法。方法采用气相色谱法，以DB-WAX石英毛细管柱为色谱柱，以高纯氮为载气，程序升温法，记录时间为50 min，以氢火焰检测器检测，并对主要共有峰进行了归属。结果用程序升温法得到了各色谱峰较好的分离，确定了27个共有峰。结论为更好地控制缬草药材的内在质量提供了可靠的方法。
【关键词】 缬草油 超临界 气相指纹图谱
缬草Valeriana officinalis L,宽叶缬草V. officinalis L var llatifolia Miq,黑水缬草V.amurensis Smir ex Kon和蜘蛛香V.jatamansi Jones为4种常见的败酱科缬草属植物。论文学术科研网缬草民间用于治疗神经衰弱、心悸失眠等症；蜘蛛香主治腹痛腹泻、消化不良等疾病。 现代药理研究表明，缬草油为其镇静催眠作用的主要有效部位，为评价不同品种、产地及采收期的药材提取物的品质差异，指导临床用药，对其进行了气相指纹图谱的研究。
1 仪器与材料
HA-221-40-11-C型超临界CO2萃取装置（江苏南通华安公司），SHIMADZU GC-14C气相色谱仪(SPL-14C进样器，FID检测器，WA-2A型无油气体压缩机)，N2000色谱工作站，高纯N (99．999％)，高纯H (99．999％)；BP-211D型十万分之一分析天平(德国Satorius)。乙醚（分析纯）。13批缬草来源见表1。
表1 超临界CO2萃取缬草油样品的药材来源
样品编号品种产地采收期1缬草湖北恩施2007??102缬草湖北恩施2007??093缬草湖北恩施2007??084缬草湖南湘西吉首2007??105缬草湖南湘西吉首2007??096缬草湖南湘西吉首2007??087缬草贵州剑河县2007??108缬草贵州剑河县2007??089黑水缬草湖南湘西花昙县2007??1010宽叶缬草湖北恩施2007??1011缬草湖北恩施2006??0112蜘蛛香湖北恩施巴东2007??1013蜘蛛香湖南湘西花昙县2007??10
2 方法与结果
2.1 色谱条件载气为氮气（N2），供试品溶液进样量1 μl，分流比10∶1，载气流速1.8 ml/min，柱前压50 kPa，DB-WAX石英毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），进样口温度250℃，检测器温度250℃，柱起始温度80℃。
2.2 供试品溶液的制备分别称取13批缬草药材250 g，粉碎，过40目筛，置超临界CO2萃取装置中进行提取（萃取压力12 Mpa，萃取温度45℃，分离温度35℃,萃取时间1 h），得到的提取物置分液漏斗中，用乙醚多次萃取，合并乙醚液，加无水硫酸钠脱水后，用乙醚定容于25 ml容量瓶；分别精密量取上述乙醚溶液1 ml，置5 ml容量瓶中，精密加入内标物萘的乙醚溶液（1.56 mg/ml）4 ml，乙醚定容，混匀，作为供试品溶液。
2.3 对照品的制备精密称取乙酸龙脑酯和缬草烯酸适量，用醋醚溶解，并稀释成一定浓度的各对照品溶液。
2.4 指纹图谱及技术参数
2.4.1 GC指纹图谱的测定分别精密吸取供试品溶液1 μl，注入气相色谱仪，按上述色谱条件操作，考察120 min内供试品溶液的色谱分离情况，记录50 min色谱图。其结果见图1。
图1 缬草油气相色谱图
2.4.2 共有指纹峰的标定根据13个批次提取物的检测结果，比较其色谱图，其中有3批样品与其他10批样品差异较大，故取其中相似的10批（以相对保留时间）标定其共有峰共27个，以内标物萘色谱峰为参照峰S，测定各共有峰相对保留时间和相对峰面积的比值，计算结果表明，各批样品共有峰相对保留时间的RSD<3%，见表2。表2 共有峰的相对保留时间“-”表示峰面积太小，无法积分
2.4.3 共有峰峰面积比值 计算各样品中共有峰占总峰面积的比值，结果表明前10批样比值均大于90％，符合指纹图谱的技术要求，而后3批不宜列入指纹图谱计算之列。见表3。 表3 共有峰占总峰面积的比值
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2.4.4 n强峰的标定根据指纹图谱技术要求，其n强峰的总面积和占整个峰面积的70％以上，且峰数占总峰数的1/5～1/3，比较各批色谱图，其共有峰中的2，5，6，8，19，22，26号峰的总和约占总峰面积的8
80%， 且第26号为主要有效成分，故标定第2，5，6，8，19，22，26号峰为该10批样品指纹图谱的七强峰。
2.4.5 共有峰的归属分别将乙酸龙脑酯和缬草烯酸的标准品溶液按所建立指纹图谱的色谱条件测定，与指纹图谱比对，2号峰为乙酸龙脑酯，26号峰为缬草烯酸。见图1。
2.5 方法学考察为了考察分析方法的可靠性，以1号样品为测定对象，对仪器的精密度、方法的重现性以及样品的稳定性等方面进行了考察。
2.5.1 精密度实验取同一供试品溶液，连续进样6次。结果表明，其共有峰相对保留时间的RSD小于3％ ，峰面积占总峰面积10％以上的共有峰，其相对峰面积的差值均不超过25％，符合指纹图谱的技术要求［1］。表明仪器的精密度良好。
2.5.2 重复性实验取1号样品6份，分别按照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，分别进行测定。结果表明，其共有峰相对保留时间的RSD小于3％ ，峰面积占总峰面积10％ 以上的共有峰，其相对峰面积的差值均不超过25％，符合指纹图谱的技术要求。表明方法的重复性良好。
2.5.3 稳定性实验实验方法同精密度实验。结果表明，供试品溶液在12 h内基本稳定。
3 讨论
本研究建立了缬草超临界CO2萃取缬草油部位GC指纹图谱。标定出27个共有峰。
超临界CO2萃取法提取缬草油较水蒸气蒸馏法有诸多的优势：如提取温度低，可以减少不稳定成分的损失，保持疗效；以CO2流体为溶剂，CO2最后以气体形式逸出，无毒害或无有机残留等。
本实验分别对4种不同极性的毛细管柱作比较，即DB??1， ZB ??5，ZB??17和ZB??WAX，结果表明用DB??WAX石英毛细管柱分离效果明显优于其它毛细管柱；在温度的选择上，采用多阶升温，色谱峰得到较好的分离。
3.4 对不同来源、产地及采收期的样品进行了比较，发现不同来源缬草中蜘蛛香（见图2）与同属其他植物差异较大，而缬草、黑水缬草、宽叶缬草之间差异较小；不同产地缬草分析结果表明，湖南、湖北和贵州省各地药材资源品质相近；从采收期来看，8，9，10三个月的鲜品差异较小，而两年前缬草样品（见图3）同新鲜采收的药材成分比例存在显著差异，乙酸龙脑酯含量明显降低，成分种类也有一定的变化，说明缬草挥发性成分不稳定，也印证了临床上缬草要鲜用的道理。
图2 蜘蛛香油气相色谱图
图3 缬草（两年前样品）油气相色谱图
【参考文献】
［1］ 国家药品监督管理局．中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)［S］．中成药，2000，22(10)：67.