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作者：戈延茹，张春燕，姜树红
【摘要】 目的优选桑黄多糖的提取、精制工艺。方法采用正交实验设计优选桑黄多糖提取工艺。通过吸附法与醇沉法的比较，选出最佳精制工艺。结果桑黄多糖最佳提取工艺为：粉碎粒度60目，浸泡12 h，用14倍的水，提取3 h，用壳聚糖吸附法精制多糖。结论浸泡时间对实验影响较大，采用壳聚糖吸附法精制，多糖损失少，此提取精制工艺方法可行。论文学术科研网
【关键词】 桑黄； 多糖； 正交设计； 提取； 精制
Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction and purification method of the polysaccharide of Phellinus igniarius.MethodsThe bset extract method of the polysaccharide was determined by orthogonal design. Through the comparison of the ethanol extraction and adsorbing purification, the best purification method was chosen. ResultsThe best extraction method of the polysaccharide in the Phellinus igniarius was :the Phellinus igniarius granularity was about 60 screen mesh,the immersion time was12 h, the solvent is water and the material 14:1, and extracted 3 times . Chitosan absorbing purification was used to extract the Phellinus igniarius.Conclusionthe immersion time greatly influenced the extraction of Phellinus igniarius .Chitosan absorbing purification was used to extract the Phellinus igniarius and the polysaccharide losses little. The extraction and purification technology of Phellinus igniarius is feasible.
Key words：Phellinus igniarius; Polysaccharide; Orthogonal design; Extraction; Purification
桑黄［1］是寄生于桑树的一种药用真菌。拉丁名为Phellinus igniarius，是担子菌亚门，层菌纲， 多孔菌目，多孔菌科，针层孔菌属类真菌。国内外研究表明桑黄具有抗肿瘤作用［2］，有关文献［3］报道灵芝、桑黄及阿加里斯茸等真菌类植物具有一定的抗癌作用，实验表明桑黄的抗癌效果最佳，其主要有效成分为桑黄多糖。桑黄的多糖类物质是影响生物机体内免疫机构的淋巴球增殖及其活性物质的重要物质，依靠免疫活性的媒介作用，使之增加对外部因子的免疫性，造成癌细胞的破坏，具有在生物内副作用少的优点，因此对桑黄多糖的提取工艺研究具有重要的意义。本研究采用正交实验设计优选出最佳方案，采用吸附法，多糖损失少，为多糖的提取精制提供了有效途径。
1 仪器与试剂
1.1 仪器UV-7504紫外可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；SC202-0型电热恒温干燥箱（上海申通实验电器厂）；BUCHI Rotavapor R-200 ?} BUCHI Heating Bath B-490 减压蒸馏仪；HH-S数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）；80-2离心沉淀机（上海跃进医疗器械厂）；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；电动搅拌器电机（金坛市中大仪器厂）。
1.2 药材试剂桑黄（吉林省延边特产研究所）；壳聚糖（浙江永跃海洋生物有限公司）；葡萄糖［AR，中国医药（集团）上海化学试剂公司］；其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 含量测定［4］
2.1.1 标准曲线的绘制
葡萄糖标准溶液的配制：
：精确称取干燥恒重(105℃)的葡萄糖25. 1 mg ，置250 ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，配成浓度为100. 4 μg/ ml 标准葡萄糖溶液备用。
5%苯酚试剂的配制：称取蒸馏后苯酚7. 5 g ，加水150 ml溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。
标准曲线的绘制：精确量取葡萄糖标准溶液0.1,0.2,0.3,0.5,0.7,0.9 ml 置干燥试管中分别再加水使其成1.0 ml，再分别加入5 %苯酚溶液2.0 ml ，摇匀。然后加浓H2SO47.0 ml ，充分摇匀，室温放置25 min ，在490 nm 处测定其最大吸光度，同时做一空白。以吸光度对葡萄糖浓度线性回归，得回归方程为Y＝0.063 4X+0.010 4(r＝0.992 2，n＝6)。实验表明，葡萄糖在0.91～9.16 μg/ml范围内呈现良好的线性关系。见图1。
图1 标准曲线（略）
2.1.2 样品测定样品经处理后(供试品溶液的制备)，移至250 ml容量瓶中，定容，摇匀，精确吸取2 ml到25 ml容量瓶，定容，摇匀成为样品液。测定时，精确吸取样品液1 ml ，按测定标准曲线同样方法测其吸光度值，按下式计算多糖含量：
多糖含量（%） = CD/ W×100%
式中：C为样品溶液中葡萄糖的浓度(μg/ml) ；D为样品溶液的稀释倍数，W为生药的重量(μg) 。
2.2 桑黄多糖提取工艺的选择
2.2.1 制定考察因素与水平［5］据文献调研及实验经验，采用水提取，提取温度为100℃，其中粉碎粒度(A)，浸泡时间(B)，提取时间(C)，水料比（D）对实验结果有影响，本实验采用正交设计法选定4者为因素，各取3水平，如表1所示，以桑黄多糖含量为考察指标进行实验。
表1 影响因素及水平L9（34）（略）
2.2.2 正交结果分析见表2～3。
表2 结果与分析（略）
表3 显著性分析（略）
由表2，表3可以看出，桑黄多糖提取最佳工艺为A3B2C3D3，即：粉碎粒度为60目，浸泡12 h，提取时间为3 h，水料比1：14。显著性B>C>D>A，F0.10水平上B因素对实验结果有显著影响。
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2.3 桑黄多糖精制工艺的选择［6，7］
2.3.1 药材的提取取桑黄药材100 g,按最佳提取方案提取，提取液过滤，合并滤液，浓缩至400 ml，定容到500 ml容量瓶中备用。
2.3.2 水提液的制备取3份药材提取液，每份1 ml，置250 ml容量瓶中，定容即得水提液供试品。用“2.1.2”项条件测定多糖的含量，重复做3次。结果见表4所示。
表4 最优方案所得多糖含量（略）
2.3.3 醇沉法精制取3份药材提取液，每份10 ml，分别加入95%乙醇，使乙醇浓度达到70%，冰箱内静置24 h，然后过滤，滤液再加入95%乙醇，使乙醇浓度达到90%，冰箱内静置24 h，过滤，滤渣水溶解，定容至50 ml容量瓶中，精密吸取2 ml置50 ml容量瓶中，定容至刻度，即得醇沉法供试液。用“2.1.2”项条件测定多糖的含量，重复做3次。
2.3.4 壳聚糖吸附法精制壳聚糖吸附剂的配制：将壳聚糖用1%醋酸配成1%溶液。壳聚糖吸附剂的用量确定：取20份桑黄水提液，每份5 ml，分别加入壳聚糖吸附剂 5，10，15，20，25，30，……100 d，结果加入壳聚糖吸附剂25 d时澄明度最好。壳聚糖吸附法精制工艺：取3份桑黄，每份25 ml，分别加入壳聚糖吸附剂 125 d，置60℃的水浴上加热并以搅拌速度为100 r/min的搅拌15 min，放置至澄清为止，过滤，滤液置100 ml容量瓶中定容至刻度，精密称取1 ml置25 ml容量瓶中，定容至刻度，用“2.1.2”条件测定多糖的含量，重复做3次。
2.3.5 多糖含量比较分别按以上两种方法测定桑黄多糖的含量,按下式进行计算。结果见表5。
多糖含量（%）=（C×D/W）×100%
式中:C为样品液中葡萄糖的浓度(μg/ml)，D为稀释倍数，W为样品的粗多糖量(μg)
表5 两种精制方法结果（略）
由表5可以看出，在两种精制方法中，壳聚糖吸附精制法所制备的桑黄多糖含量较醇沉法明显提高，故本实验采用壳聚糖吸附法精制，壳聚糖吸附法多糖损失少。 P>
3 讨论
植物多糖是近年来越来越被人们重视的中药成分，广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一。多糖有免疫调节，抗肿瘤等作用，并且对机体的毒副作用比较小。因此对多糖的研究已成为医药界的热门领域。
正交设计是有效的实验设计方法，通过对它的应用既可节约大量时间，又可较好达到实验目的，越来越多的应用于科研实验。
本实验含量测定方法采用目前国内应用较多的苯酚-浓硫酸法，机理为：多糖在硫酸作用下先水解成单糖，并迅速脱水，生成糖醛化合物，在490 nm左右处有吸收。具体测定波长可根据扫描结果得到。由于实验采用比色法，所以误差较大，需要探寻更有效的方法。
壳聚糖是一种新型高分子材料，无毒，另外壳聚糖加入乙酸中可以加速其澄清速度，所以壳聚糖吸附桑黄多糖较好，且多糖损失较醇沉少。
【参考文献】
［1］ 薛忠明,白克明,黄建华.桑黄及其药用研究进展［J］.中国蚕业,2007,28（1）:71.
［2］ 张 敏,纪晓光,贝祝春,等.桑黄多糖抗肿瘤作用［J］.中药药理与临床,2006,22（3、4）:56.
［3］ 温 克,陈 劲,李 红,等.桑黄等四种抗癌药物抗癌活性的比较［J］.吉林大学学报（医学版）,2002,28（3）:247.
［4］ 董 群,郑丽伊,方积年.改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究［J］.中国药学杂志,1996,31（9）：550.
［5］ 郭树凡,张慧丽,李 昱,等.桑黄子实体多糖提取条件的研究［J］.食用菌学报,2006,13(4):49.
［6］ 吴 琼,李三鸣,姜爱萍,等.红景天提取液精制工艺的考察［J］.时珍国医国药,2005,16(5):395.
［7］ Gi-Young Kim, Hyung-Sik Park, Byong-Hyok Nam.Purification and characterization of acidic proteo-heteroglycan from the fruiting body of Phellinus linteus (Berk. & M.A. Curtis)Teng［J］.BioresourceTechnology，2003,89（1）:81.