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作者：肖萍 杨丽 游劲松 史彩虹 曾群
【摘要】 目的 考察以卵磷脂、胆固醇为膜材制备的两性霉素B脂质体的稳定性及降解动力学。方法 应用高效液相色谱法考察光和热对两性霉素B溶液及其脂质体中药物稳定性及降解动力学的影响，并拟合其降解动力学模型，求算降解半衰期。结果 两性霉素B溶液及其脂质体光降解分别符合一级和零级动力学过程，降解半衰期分别为2.6和24.7d；热降解过程分别符合零级动力学和Higuchi方程；40℃下半衰期分别为27.8和1532.8d；60℃下半衰期分别为8.2和17.9d。结论 脂质体可明显降低两性霉素B的光和热降解，延长药物降解半衰期，显著提高两性霉素B的稳定性。
【关键词】 两性霉素B； 卵磷脂； 胆固醇； 脂质体； 稳定性； 降解动力学
ABSTRACT Objective To study the stability and degradation kinetics of amphotericin B in liposome. Methods The light and thermal stabilities of amphotericin B in liposome and solution were determined by detecting its content using HPLC and the degradation kinetics was also investigated. Results The light degradation kinetics of amphotericin B in liposome and solution fit the zero- and first-order equations, and their half lives were 24.7d and 2.7d, respectively. While their thermal degradation kinetics complied with the Higuchi model and zero-order equations, respectively. The amphotericin B in liposome was more stable than that in solution at 40℃ and 60℃. The half lives of amphotericin B in liposome and solution were 1,532.8d and 27.8d at 40℃, but 17.9d and 8.2d at 60℃, respectively. Conclusion The liposome can improve the light and thermal stabilities of amphotericin B significantly.
KEY WORDS Amphotericin B; Egg phospholipid; Cholesterol; Liposome; Stability; Kineticsequation
近年来，深部真菌感染的发病率有升高趋势，且病情大多严重，病死率高，特别在严重全身性疾病(如恶性肿瘤、血液病)基础上免疫功能明显下降以及长期应用广谱抗生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素或放疗、化疗时更容易发生。论文学术科研网随着器官移植、骨髓移植等新技术的发展以及AIDS病患者的增多，深部真菌感染率及病死率上升更明显。目前，两性霉素B(amphotericin B，AMB)是治疗深部真菌病疗效最确切的药物［1］，它对念珠菌、隐球菌、毛霉、曲霉、组织胞浆菌、球孢子菌等大多数深部真菌都具有强大的抗菌作用［2］，但由于其严重的毒副作用，特别是肾毒性，使其临床应用受到限制。临床研究表明将其制成脂质体后可大大降低其毒副作用［3～6］。由于AMB本身稳定性较差，对光、热均不稳定，本文考察了天然磷脂制备的脂质体对AMB稳定性及降解动力学的影响。
1 仪器与试药
Jasco高效液相色谱仪(日本分光公司)，PU-1580液相色谱泵(日本分光公司)，UV-1575紫外检测器(日本分光公司)，Climacel 222型人工气候箱(德国MMM公司)，LS230激光粒度分析仪(Beckman Coulter Co.)。
AMB(华北制药集团新药研究开发中心)，AMB对照品(中国药品生物制品检定所)，二甲基亚砜(DMSO，天津科密欧化学试剂开发中心)，乙腈(天津康科德科技有限公司) )，Na2 EDTA(沈阳化学试剂厂)，卵磷脂(上海东尚实业有限公司)，胆固醇(上海化学试剂站分药厂)。
2 方法和结果
2.1 两性霉素B脂质体的制备及性质考察
(1)两性霉素B脂质体(AMB-L)制备［7］ 分别定量称取卵磷脂、胆固醇于圆底烧瓶中用氯仿溶解，定量称取AMB用甲醇溶解，将两者混合后于55℃恒温水浴中旋转减压蒸发去除有机溶剂，形成均匀类脂薄膜，以氮气吹干残余溶剂，放入真空干燥箱内，真空干燥过夜。加入3%的甘露醇水溶液10ml至烧瓶中，50℃旋转洗膜1h，使脂质膜充分溶胀水化，得到脂质体混悬液。将混悬液用探针式间歇超声，用0.45、0.22μm微孔滤膜依次过滤，4℃冷藏保存。应用激光粒度分析仪测定所制备AMB-L的粒度，透射电镜观察其形态，参考文献报道的方法［8］测定其包封率。
测定结果表明所制备AMB-L的平均粒径为(137±20)nm，90%的粒子小于164nm，粒子的粒径范围为77～214nm。透射电镜观察其形态为单室脂质体。包封率测定为94%。
(2)两性霉素B脂质体溶血性质的考察［9］ 取家兔血，放入盛有玻璃珠的锥形瓶中振摇，除去纤维蛋白原，1500r/min离心15min，收集沉下的红血球，用生理盐水洗涤2～3次，至上清液不显红色为止，将所得红细胞用生理氯化钠溶液配成2%的混悬液，即得。
取具塞刻度试管，按Tab.1方法依次加入各种溶液，其中7号管为生理盐水空白对照，8号管为阳性对照(蒸馏水)。各管轻摇混匀后，于37℃水浴中放置3h，每隔30min观察各管溶血程度，结果见Tab.1。溶血程度按如下标准：无溶血(-)，红细胞全部下沉，上层?体无色透明；部分溶血(±)，溶液澄明，红色或棕红色，管底尚有少量红细胞残留；全溶血(+)，溶液澄明，红色，管底无红细胞残留；凝集，虽不溶血，但出现红细胞聚集，振摇后不能分散。
2.2 AMB含量测定方法
选择HPLC法检测AMB和AMB-L稳定性试验样品中的药物含量。
色谱条件［10，11］ 色谱柱：HiQ sil C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈∶0.02mol/L∶Na2EDTA (45∶55，V/V)；流速1.0ml/min；柱温为室温；检测波长407nm；进样量10μl。
含量测定 精密量取待测样品1ml，加入少量DMSO，用乙腈∶2.5mmol/L Na2EDTA(60∶40，V/V)溶液稀释适宜倍数，制成药物浓度约为5μg/ml的溶液，摇匀，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，另取AMB对照品同法配制溶液和测定，按外标法以峰面积计算含量。含量测定色谱图见Fig.1，AMB的保留时间是6.917min；其余为溶剂峰。
经方法学研究表明该方法专属强、准确、精密，可作为AMB稳定性研究的分析方法。
2.3 数据处理
稳定性试验中测定的药物含量分别按Tab.2所列方程进行拟合处理［12］，选取拟合度最大的模型计算药物降解半衰期。
2.4 稳定性试验
(1)稳定性试验样品 取AMB原料药，用DMSO
Fig.1 HPLC Chromatograms of sample∶甲醇(1∶1)溶解［13，14］，制成浓度约4.0mg/ml溶液，分装于2ml的安瓿中，每瓶分装1ml。AMB-L分装于2ml的安瓿中，每瓶1ml。
(2)光照试验取AMB溶液和AMB-L样品，放于人工气候箱中光照(5000±500)Lx，分别于0、1、5和10d取样，照2.2项下方法测定药物含量，结果见Tab.3和Fig.2。
按Fig.1中动力学方程拟合，结果表明在光照条件下，AMB溶液和AMB-L的光降解分别符合一级和零级动力学过程，降解动力学方程分别为：
lgC=-0.118t+0.547(r=0.96)
C=-2.053t+101.4(r=0.96)
降解速率常数分别为0.118和2.053%/d，半衰期分别为2.6和24.7d。
学术科研网 (3)加速试验 取AMB溶液和AMB-L样品，放于40℃和60℃恒温箱中， 分别于0、1、5和10d取样(AMB溶液增加d8)，照2.2项下方法测定药物含量，结果见Tab.4和5，Fig.3和4。
结果表明，AMB溶液在40℃和60℃条件下 降解过程均符合零级动力学过程，降解动力学方程分别为：
C=-1.791t+99.84(r=0.965)
C=-5.882t+96.19(r=0.992)
降解数率常数k分别为1.791和5.882%/d，半衰期分别为27.8和8.2d。AMB-L在40℃和60℃条件下，降解过程均符合Higuchi降解动力学过程［12］，降解动力学方程分别为：
C=-1.306t1/2+99.46(r=0.945)
C=-11.504t1/2+97.53(r=0.984)
降解速率常数k分别为1.306和11.504%/d1/2，半衰期分别为1532.8和17.9d。
3 讨论
(1)AMB-L是目前已上市脂质体制剂中的一种，国外已上市的AMB-L(商品名：AMBisome)是以氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰甘油和胆固醇为主要脂质体膜材，产品价格相对较高［1］。本文主要以价格较低的天然磷脂、胆固醇为膜材制备AMB-L制剂，考察了与其溶液相比的光、热稳定性和降解动力学的变化，从动力学角度证明了天然磷脂制备的脂质体使AMB稳定性的提高。该研究未见文献报道。
(2)通过对AMB-L性质的考察，可知所制备的AMB-L的粒度较小，且包封率较高。体外溶血试验表明，在3h内，AMB-L在药物浓度35～224μg/ml时均无溶血现象，而AMB溶液在浓度为10μg/ml即出现溶血。以上数据表明本文所制备的天然磷脂AMB-L能有效降低药物的溶血，分析其原因可能是：AMB的抗菌机制是与真菌细胞膜上的麦角甾醇结合导致细胞表面形成许多小孔，膜渗透性增加，细胞内成分外漏而致细胞死亡。AMB也可与红细胞表面的胆固醇结合，导致红细胞破裂；而AMB-L将药物包封于脂质体中，有效降低了药物与红细胞表面的胆固醇结合，大大降低了AMB-L的溶血性，也说明了本文制备AMB-L稳定性良好，药物不易渗漏。
(3)由数据可知，AMB溶液和AMB-L的光降解分别符合一级和零级动力学过程，AMB溶液在光照条件下降解非常严重，10d降解94.5%；而AMB-L可有效减慢药物的光降解。分析其原因可能是药物被脂质体包裹后，减弱了光直接照射的强度，从而降低了药物的降解速度。
(4)AMB溶液在40℃和60℃的降解均符合零级动力学过程，而AMB-L在40℃和60℃的降解均符合Higuchi model过程，说明AMB制成脂质体脂质体后，改变了药物的热降解动力学过程。两种剂型都是随温度升高，药物降解加快，但与溶液剂相比，脂质体显著提高AMB的热稳定性，40℃加热10d AMB-L仅降解4.20%，且脂质体粒度没有明显变化，而AMB溶液在40℃ 10d降解了17.9%。由此说明，AMB做成脂质体后，热稳定性明显提高，药物的半衰期显著延长，AMB溶液在40℃下半衰期为27.8d，AMB-L在40℃下半衰期为1532.8d。在60℃的高温下，AMB溶液的降解速度大于其脂质体的降解速度，10d后溶液降解63.9%，其脂质体降解了39.2%，半衰期分别为8.2d和17.9d。
(5)文献报道［12］，以氢化磷脂、胆固醇作为膜材的AMB-L，在30℃和45℃温度下，降解动力学过程均符合Higuchi方程，与本文所制备的卵磷脂、胆固醇为膜材的AMB热降解动力学过程相同，但其在45℃温度下的降解速率常数(6.25%/d1/2)较本文制备的AMB-L(1.31%/d1/2)大，降解速率加快，分析其原因可能是两种脂质体药物包封的位置有所不同，这还有待于进一步验证。
综上结果表明脂质体具有显著提高AMB的光和热稳定性的作用。
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