【www.tuzhexing.com--医学类】
作者：叶放，赵文霞，苗明三，李建国，张永艳 【关键词】 ,化痰泄浊方
［摘要］ 目的：探讨化痰泄浊方对大鼠脂肪肝的作用。方法：将SD大鼠随机分为5组：正常对照组、模型组、东宝肝泰组、化痰泄浊方高剂量和低剂量组。用高脂饮食联合四环素腹腔注射法制作大鼠脂肪肝模型，观察大鼠肝脏组织的病理变化，并检测肝功能、血清瘦素、胰岛素抵抗指数，以及肝匀浆甘油三酯（triglyceride, TG）和游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）的含量。结果：各用药组的血清瘦素、胰岛素抵抗指数及肝匀浆FFA、TG含量均显著低于模型组（P<0.01），且化痰泄浊方组的抗脂肪肝作用显著优于东宝肝泰组（P<0.05）。结论：化痰泄浊方治疗脂肪肝的作用机制主要为促进脂质代谢、改善胰岛素及瘦素抵抗。
［关键词］ 化痰泄浊方; 脂肪肝; 游离脂肪酸; 胰岛素抵抗; 瘦素抵抗
Effects of Huatan Xiezhuo Recipe on insulin resistance and leptin in rats with fatty liver
ABSTRACT Objective: To observe the effects of Huatan Xiezhuo Recipe (HTXZR) on fatty liver of rats. Methods:Fortyeight SD rats were randomly divided into five groups: normal control group, untreated group, Dongbao Gantai Tablet (DBGTT)treated group, lowdose HTXZRtreated group and highdose HTXZRtreated group. Fatty liver was induced in the rats by hyperlipid diet and intraperitoneal injection of tetracycline. The pathological changes of liver tissues in rats were observed, and the liver function, serum leptin, insulin resistance index, triglyceride (TG) and free fatty acid (FFA) in the liver were detected. Results: The levels of serum leptin, insulin resistance index, FFA and TG in rats of the three treated groups were lower than those of the untreated group (P<0.01), and such effects in the HTXZRtreated groups were more significant than those in the DBGTTtreated group (P<0.05). Conclusion:The main action mechanisms of HTXZR in treating fatty liver are probably to promote the lipid metabolism, decrease the leptin and insulin resistance.
KEY WORDS Huatan Xiezhuo Recipe; fatty liver; free fatty acid; insulin resistance; leptin resistance
当外源性脂肪酸供给增加，游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）运输至肝脏过多时，肝细胞内FFA合成甘油三酯（triglyceride, TG）就会增多，从而导致肝内脂肪堆积。既往研究表明，胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）和瘦素（leptin）抵抗以及两者之间的相互作用在脂肪肝发病机制中起着重要的作用［1,2］。化痰泄浊法是中医治疗脂肪肝最常用的治法。本实验旨在研究化痰泄浊方（Huatan Xiezhuo Recipe, HTXZR）对高脂饮食联合四环素腹腔注射所致大鼠脂肪肝模型的干预作用及影响环节。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1. .1 动物 健康雄性SD大鼠48只，体质量（150±10）g，河南医科大学动物实验中心提供。饲养于室温（20±3）℃、明暗各12 h的清洁级动物实验室中，予以自由饮水和进食。
1.1.2 药物与试剂 化痰泄浊方浓缩液由泽泻、荷叶、莱菔子、大黄按生药比例4∶3∶2∶1制成，浓缩液含生药2 g/ml，由河南中医学院第一附属医院制剂室生产，批号20020415；东宝肝泰片（Dongbao Gantai Tablet, DBGTT）由中国通化东宝药业股份有限公司生产，0.4 g/片，批号011106；四环素粉针剂，250 mg/支，江苏常州动物保健品有限公司生产，批号010903；胆固醇（分析纯），购自上海化学试剂站分装厂，批号010903；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）检测试剂盒，购自四川迈克科技有限责任公司；TG试剂盒，购自温州东欧生物工程有限公司；FFA测试盒，购自南京建成生物医学研究所；胰岛素放射免疫分析药盒(批号020615)、瘦素放射免疫分析药盒(批号020617)，中国原子能科学研究所提供。
1.1.3 主要仪器 LXJⅡ离心沉淀机，上海医用分析仪器厂生产；722型光栅分光光度计、7150型（BT2000）全自动生化分析仪、H7500透射电子显微镜，日本日立公司产品。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制作 SD大鼠48只，常规饲养1周后随机分为5组：正常对照组、模型组、DBGTT组、HTXZR高剂量和低剂量组，其中正常对照组8只，其余4组各10只。正常对照组予以基础饲料喂养，其余4组均以高脂饲料（84％基础饲料＋10％猪油＋5%蛋黄粉+1％胆固醇）喂养，并于造模第1天予以腹腔注射四环素150 mg/kg，后每隔6 d腹腔注射四环素110 mg/kg 1次，共6次。
1.2.2 给药方法 自造模第1天起，除正常对照组外，其余各组均按5 ml・kg1・d1，1次/d，分别灌服生理盐水或相应的药物溶液。HTXZR高剂量和低剂量组的给药浓度分别为HTXZR 2 g/ml和1 g/ml（相当于成人用药剂量的20倍和10倍）；DBGTT溶于蒸馏水中，制成浓度为0.06 g/ml的溶液，给药浓度为0.225 g・kg1・d1（相当于成人用药剂量的10倍）。连续7周。
1.2.3 标本采集 于造模第7周结束时处死各组动物。方法：隔夜禁食，次日以2％戊巴比妥钠溶液按1 ml/kg予以腹腔内注射麻醉后，自腔静脉采血，然后迅速取出肝脏称取肝湿重，取肝左叶组织0.1 cm×0.1 cm×0.6 cm标本2～4块用戊二醛固定，再取肝左叶组织0.5 cm×1 cm×0.3 cm标本1块，用10％磷酸缓冲甲醛液固定。最后将剩余肝组织于－70 ℃保存，待作肝匀浆。所采血液于30 min之内离心取血清待检。
1.2.4 检测指标及测定方法 （1）血清生化指标检测：采血5 ml静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，取血清用全自动生化分析仪检测血清中TG、ALT、AST和血糖水平。（2）血清瘦素及空腹胰岛素定量：采用放射免疫法，按推荐公式计算胰岛素抵抗指数（胰岛素抵抗指数=空腹血糖含量×空腹胰岛素含量/22.5）［3］。（3）肝匀浆TG检测：取肝左叶组织0.2 g，4 ℃下制成10%肝匀浆，用氯仿∶甲醇为2∶1溶液抽提脂质，取上清可溶部分，用酶法测定TG（单位：mmol/L），代表肝内脂肪含量。（4）肝匀浆FFA检测：取1％肝匀浆，离心后取上清液30 μl，在722型光栅分光光度计上进行比色，用酶法检测，按试剂盒操作步骤进行。
1.2.5 肝脏病理观察 （1）光镜观察：取肝左叶，中性甲醛固定肝标本，予以石蜡切片，HE染色后，观察肝脏组织的病理变化。（2）电镜观察：标本经戊二醛固定，环氧树脂包埋，超薄切片后用透射电镜观察肝脏组织超微结构的变化。
1.2.6 统计学方法 所有实验数据均用SPSS 10.0统计软件进行分析，计量资料以x±s表示，采用多因素方差分析的两两比较法，等级资料采用秩和检验。
论文参考网 2 结果
2.1 各组大鼠肝湿重与肝指数的变化 模型组中有1只大鼠在第3次注射四环素后被大鼠间争咬致死，原因未明。其余大鼠腹腔肥大，脂肪组织丰富，解剖观察肝脏体积明显增大，包膜紧张，呈砖红色，切面有油腻感，呈典型脂肪肝外观；而 DBGTT组和HTXZR高、低剂量组大鼠腹腔的脂肪组织较模型组少，肝脏体积稍大，呈黄色，部分大鼠肝脏切面有油腻感。模型组、DBGTT组和HTXZR高、低剂量组大鼠的肝湿重和肝指数均明显大于正常对照组（P<0.01）；DBGTT组和HTXZR高、低剂量组的肝湿重与肝指数均明显小于模型组（P<0.05）；而HTXZR高、低剂量组与DBGTT组之间肝湿重的比较无统计学意义，HTXZR低剂量组与DBGTT组之间肝指数的比较则有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠肝组织的病理变化 正常对照组大鼠肝组织形态学基本正常；模型组大鼠呈中～重度肝细胞脂肪变，病变以中央静脉周围最为明显，肝细胞明显肿胀呈圆形，细胞核被挤向一边，胞浆内充满大量脂肪空泡，脂滴大小不等，甚至融合为大脂滴，少数可见有肝细胞碎屑样坏死和炎细胞浸润，未见有纤维化改变；各用药组大鼠的病理变化表现为肝细胞脂肪变呈不同程度的改善，脂肪变肝细胞数目减少，胞浆内脂滴减少或消失，胞浆丰富，肝索排列整齐，尤以HTXZR高、低剂量组改善最为明显，DBGTT组次之。透射电镜显示：模型组大鼠肝细胞索排列紊乱，胞浆脂滴大量沉积，线粒体嵴明显肿胀或出现碎裂、坏死，肝星状细胞和库普弗细胞数增多；各用药组肝细胞则排列较整齐，胞浆脂质含量较少，线粒体无碎裂、坏死，炎细胞少见。
2.3 各组大鼠血清ALT、AST、瘦素、胰岛素抵抗指数的变化 造模各组均出现不同程度的ALT、AST活性升高，以模型组最为明显；用药各组ALT、AST水平与模型组比较，有不同程度的降低，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；HTXZR高、低剂量组与DBGTT组比较差异亦有统计学意义（P<0.01）。血清瘦素水平及胰岛素抵抗指数均以模型组为最高，HTXZR高剂量组的瘦素水平与模型组和DBGTT组比较都有显著下降（P<0.05）；HTXZR高剂量组、DBGTT组的胰岛素抵抗指数与模型组相比也有统计学意义（P<0.05），但各用药组之间的比较则无明显差异。见表2。
2.4 各组大鼠肝匀浆FFA、TG及血清TG的变化 肝匀浆FFA、TG水平以模型组最高，正常对照组最低；用药各组的FFA、TG水平较模型组均有不同程度的下降（P<0.01）；HTXZR高、低剂量组FFA、TG水平与DBGTT组比较，亦有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。模型组、DBGTT组和HTXZR高、低剂量组之间血清TG水平的比较则无统计学意义。见表3。
表1 各组大鼠肝湿重与肝指数的变化（略）
Tab 1 Changes of liver weight and liver index of the rats
*P<0.05, vs untreated group; △P<0.05, vs DBGTTtreated group; ▲▲P<0.01, vs normal control group
表2 各组大鼠血清ALT、AST、瘦素、胰岛素抵抗指数的变化（略）
Tab 2 Changes of serum ALT, AST, leptin and insulin resistance index of the rats
*P<0.05, **P<0.01, vs untreated group; △P<0.05, △△P<0.01, vs DBGTTtreated group
表3 各组大鼠肝匀浆FFA、TG及血清TG的变化（略）
Tab 3 Changes of liver tissue FFA, TG and serum TG of the rats
**P<0.01, vs untreated group; △P<0.05, △△P<0.01, vs DBGTTtreated group
3 讨论
四环素能使肝脏产生广泛的微囊泡性脂肪变性，抑制线粒体内脂肪酸氧化，从而酯化合成TG增多，诱导和促进了高脂饮食大鼠脂肪肝的形成。本实验结果表明：用高脂饮食联合四环素间断腹腔注射诱导建立大鼠脂肪肝模型是一种成功可行的造模方法，其肝脂肪变性造模成功率高且造模时间短。
既往研究表明：在脂肪肝的形成和发展过程中，IR通过使外周脂肪降解以及增加肝脏对脂肪酸的摄取，促进脂肪变性的发生；IR通过抑制FFA氧化使肝脏内FFA利用减少，增加FFA在肝脏内的蓄积，进而酯化为TG在肝内储存，并通过刺激微粒体的脂质过氧化酶使肝脏易于发生氧化应激，还可通过增高胰岛素水平来抑制线粒体对脂肪酸的β氧化而发 挥作用，脂肪堆积的肝细胞会对胰岛素产生抵抗［4］。
孙丽伟等［5］研究发现，高脂饮食诱导的脂肪肝大鼠血清中瘦素水平较正常组明显升高，提示血清瘦素水平与高脂饮食所致脂肪肝的病情发展有关。梁坚等［6］、黄伟等［7］进一步研究认为：在病理状态下，胰岛素对瘦素的敏感性下降，由于瘦素和胰岛素之间的相互作用，出现高瘦素、高胰岛素水平，即瘦素抵抗和胰岛素抵抗。增加的瘦素可通过增强胰岛素抵抗和改变肝细胞内胰岛素信号而增加细胞内的脂肪酸，从而促成肝脏的脂肪变。
中医认为，痰湿是脂肪肝疾病早、中期的主要病理产物，因此，深入研究化痰泄浊法对脂肪肝的作用机制具有重要意义。化痰泄浊方由泽泻、莱菔子、大黄、荷叶等组成，方中泽泻利水、渗湿、泄浊，切中本病湿痰郁积的病机，重用为君药；莱菔子消食化积、降气化痰，大黄导湿热、清瘀热、下瘀血，二者合用共助主药渗湿祛浊之功；荷叶芳香轻宣、升清降浊，具有化湿醒脾之功，可升发清阳、分利清浊，以防君、臣药渗泄太过，为佐使药。
本实验结果显示：高脂饮食及四环素腹腔注射所致大鼠脂肪肝模型的IR指数、瘦素水平均显著升高，而各药物治疗组的IR指数、瘦素水平则明显降低，说明化痰祛浊方能改善IR及瘦素抵抗，具有一定的抗脂肪肝作用。
［参考文献］
1 杨正武, 魏良州. 瘦素抵抗、胰岛素抵抗与非酒精性脂肪肝病［J］. 医学综述, 2004, 10(6): 335338.
2 吴木潮. 瘦素与代谢综合征［J］. 国外医学・内科学分册, 2000, 27(12): 519521.
3 钟 岚, 范建高, 王国良, 等. 肥胖、高脂血症性脂肪肝肝炎模型的建立［J］. 实验动物科学与管理, 2000, 17(2): 1620.
4 李光伟. 当前胰岛素敏感性评估及胰岛素抵抗研究的某些误区［J］. 中华内科杂志, 1998, 37(2): 8183.
5 孙丽伟, 陈芝芸, 严茂祥, 等. 高脂饮食脂肪肝大鼠血清TNFα、IL6、Leptin的变化［J］. 浙江中医学院学报, 2004, 28(3): 4142.
6 梁 坚, 王婉梅, 揭育丽, 等. 脂肪肝患者血清瘦素与胰岛素抵抗的关系［J］. 中国临床康复, 2004, 8(27): 58475849.
7 黄 伟, 季 峰, 姜玲玲, 等. 脂肪肝患者血清瘦素水平检测及其与发病的关系［J］. 中华检验医学杂志, 2004, 27(2): 106.