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作者：马淼 周旭莉 户元林 肖辉 李学禹
【摘要】 目的测定乌拉甘草提取物对人体４ 种肿瘤细胞的抑制效果。方法应用ＭＴＴ 法测定甘草水提物（甘草酸）与醇提物（总黄酮）对宫颈癌细胞株（Ｈｅｌａ）、乳腺癌细胞株（Ｂｃａｐ －３７）、胃癌细胞株（ＭＧＣ －８０３）以及肝癌细胞株（Ｂｅｌ －７４０４）增殖的抑制作用；运用Ｈｏｃｈｅｓｔ ３３２５８ 荧光染色剂测试其诱导细胞凋亡的生物学效应。结果甘草酸的抑瘤效果表现出浓度依赖性，与浓度呈正相关关系。高浓度甘草酸（１ ０００ μｇ／ｍｌ）对Ｂｃａｐ －３７，Ｈｅｌａ，ＭＧＣ －８０３ 的增殖均有较强的抑制作用，其抑制率分别为７６．３７％，７９．７１％，７１．０６％，对Ｂｅｌ －７４０４ 细胞增殖的抑制作用较差，抑制率仅为２４．２９％。在一定浓度范围内（２００ ～１ ０００ μｇ／ｍｌ），其对４ 种肿瘤细胞增殖的抑制率与样本浓度大小呈负相关关系，２００ μｇ／ｍｌ 剂量的甘草黄酮抑制肿瘤细胞增殖的效果最佳，其对Ｂｃａｐ －３７，Ｈｅｌａ，Ｂｅｌ －７４０４，ＭＧＣ －８０３ 等４ 种肿瘤细胞增殖的抑制率分别为７９．５５％，７９．９８％，６７．９１％以及３７．８６％。论文学术科研网甘草酸、甘草黄酮均能有效诱导这４ 种肿瘤细胞发生凋亡。结论甘草酸和甘草黄酮诱导细胞凋亡是其显著抑制肿瘤细胞增殖的重要途径。
【关键词】 乌拉甘草 甘草酸 酮 抗肿瘤 细胞凋亡
Abstract:ObjectiveＡｎｔｉ －ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｈｉｎ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Glycyrrhiza uralensis Ｆｉｓｃｈ ｏｎ ｆｏｕｒ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ （ｃｅｒｖｉｘ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ：Ｈｅｌａ， ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ：Ｂｃａｐ －３７， ｓｔｏｍａｃｈ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ：ＭＧＣ －８０３ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ：Ｂｅｌ －７４０４） ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．MethodsＭＴＴ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｎｔｉ －ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ， ａｎｄ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ －ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．ResultsＩｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｎｔｉ －ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ ｗａｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ， ｈｉｇｈｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ （１ ０００ μｇ／ｍｌ） ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ａｎｔｉ －ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ， ｗｉｔｈｉｎ ｃｅｒｔａｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ （２００ ～１ ０００ μｇ／ｍｌ）， ｉｎｈｉｂｉｔｏry ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｗａｓ ａｌｓｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ， ｔｈｅ ｌｏｗｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （２００ μｇ／ｍｌ） ｗａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏry ｅｆｆｅｃｔ， ｉｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｏｎ Ｂｃａｐ －３７， Ｈｅｌａ， Ｂｅｌ －７４０４，ＭＧＣ －８０３ ｗｅｒｅ ７９．５５％，７９．９８％，６７．９１％ ａｎｄ ３７．８６％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ConclusionＢｏｔｈ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｈａｖｅ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ －ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．
Key words:Glycyrrhiza uralensis； Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ； Ｆｌａｖｏｎｅｓ； Ａｎｔｉ －ｔｕｍｏｒ； Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
乌拉甘草Glycyrrhiza uralensis Ｆｉｓｃｈ 为豆科甘草属多年生草本植物［１］ ，是《中国药典》中收录的药用甘草之一，其性平味甘，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药之功效［２］ 。其有效成分主要为甘草酸类和甘草黄酮类物质。最近研究表明甘草酸还具有抑制肺癌细胞增殖的作用［３ ～５］ 。本研究以人宫颈癌细胞株（ Ｈｅｌａ）、人乳腺癌细胞株（Ｂｃａｐ －３７）、人胃癌细胞株（ＭＧＣ －８０３）以及人肝癌细胞株（Ｂｅｌ －７４０４）４ 种肿
肿瘤细胞作为研究对象，通过体外实验研究甘草有效成分的抗肿瘤活性及其诱导细胞凋亡的效果，为甘草提取物抗肿瘤实验的研究以及甘草新药的开发提供理论依据。
1 器材与方法
１．１ 提取物的制备
１．１．１ 甘草酸的制备乌拉甘草的根茎采自石河子大学甘草资源圃，８０℃烘干至恒重后粉碎成粉末，过４０ 目筛。准确称取１．０ｇ 样品干粉，加１０ ｍｌ 蒸馏水，于室温条件下放置４８ ｈ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ，取５００ μｌ 上清液加５００ μｌ 甲醇混匀，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ，取上清液，用孔径为０．２２ μｍ 的微孔滤膜过滤，ＨＰＬＣ 法测定甘草酸含量［６］。
１．１．２ 甘草黄酮的制备准确称取１．０ ｇ 样品粉末，用２５０ ｍｌ无水乙醇加５ 滴浓盐酸为提取剂在索氏提取器中于９５℃的水浴加热条件下提取６ ｈ，浓缩至２５ ｍｌ，冷却至室温后补足溶剂至刻度，用孔径０．２２ μｍ 的微孔滤膜过滤，用Ｆｏｌｉｎ －酚试剂法测定总黄酮含量［６］。
１．2 细胞株人宫颈癌细胞株（Ｈｅｌａ）、人乳腺癌细胞株（Ｂｃａｐ －３７），人胃癌细胞株（ＭＧＣ －８０３），人肝癌细胞株（Ｂｅｌ －７４０４），均由中国科学院上海细胞生物研究所细胞库提供。
１．３ 设备及试剂
１．３．1 仪器ＨＰＬＣ 分析仪（ｗａｔｅｒｓ）、紫外可见分光光度仪（上海棱光）、ＣＯ２ 培养箱（美国Ｆｏｒｍａ）、∑９６０ 自动酶标仪（Ｍｅｔｅｒｔｅｃｈ）、荧光显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ －５１）、超净工作台（上海净化设备厂）、血球记数板（上海医用光学仪器厂）、倒置显微镜（重庆）、超速离心机。
１．３．2 试剂ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ） 、小牛血清（杭州四季青公司）、胰蛋白酶（Ｓｉｇｍａ） 、二甲基亚砜（分析纯）、甲醇（色谱纯）、四噻唑蓝（ＭＴＴ）、顺铂（ＤＤＰ，江苏豪森药业股份有限公司）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ 染色试剂盒（碧云天生物技术研究所）。
１．４ 方法及观察指标
１．４．1 细胞培养细胞用含１０％灭活小牛血清的ＲＰＭＩ１６４０ 培养基，置于３７℃，５％ＣＯ２ 孵箱中培养。实验用细胞均处于对数生长期，常规苔酚蓝计数活细胞大于９５％。
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１．４．2 体外抗肿瘤实验体外抗肿瘤实验分５ 个浓度（１００ ～１ ０００ μｇ／ｍｌ） 、阴性对照（含同一细胞密度的培养液）、空白对照。对数生长期细胞（细胞密度为２ ×１０５ 个／ｍｌ） １００ μｌ／孔接种于９６ 孔板，３７℃饱和湿度，５％ ＣＯ２ 条件下培养６ ｈ，待细胞均已贴壁，加入１００ μｌ 不同浓度的受试物，各设５ 个复孔。在４８ ｈ取出９６ 孔板，倒置显微镜下观察后，每孔加ＭＴＴ 溶液（５ ｍｇ／ｍｌ）２０ μｌ ，３７℃继续孵育４ ｈ，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入１５０ μｌ ＤＭＳＯ，振荡１０ ｍｉｎ，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收OD 值（A ＝５７０ ｎｍ），记录结果。
抑制率（％） ＝（１ －给药组A ５７０ ／细胞对照组A ５７０ ）×１００％
１．４．３ 细胞凋亡率实验细胞凋亡实验在同一浓度下进行（甘草酸１ ０００ μｇ／ｍｌ，黄酮２００ μｇ／ｍｌ），实验设阴性对照（含同一细胞密度的培养液）、阳性对照（２００ μｇ／ｍｌ ＤＤＰ）、空白对照。取普通、洁净盖玻片于７０％ 乙醇中浸泡１０ ｍｉｎ，０．９％ ＮａＣｌ 溶液洗涤3遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为７０％ ～９０％满。加入样品，继续培养４８ｈ，吸尽培养液，加入０．５ ｍｌ 固定液，固定１０ ｍｉｎ。去固定液，用０．９％ ＮａＣｌ 洗两遍，３ ｍｉｎ／次，吸尽液体。加入０．５ ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８ 染色液，染色５ ｍｉｎ。用０．９％ＮａＣｌ 洗两遍，３ ｍｉｎ／次。滴１滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片。荧光显微镜下（Ｅｘ３５０ ｎｍ，Ｅｍ４６０ ｎｍ）随机选取１０ 个视野拍照后计数。凋亡率（%）＝凋亡细胞／（视野总细胞数） ×１００％。
１．５ 统计学处理实验所得所有数据均经ＳＰＳＳ １２．０软件处理并对处理组间进行单因素方差分析，P＜０．０５ 时表示存在显著性差异。
2 结果
２．１ 甘草酸体外抗肿瘤实验结果光镜下观察到，未经任何处理的肿瘤细胞接种４８ ｈ 后，细胞约占孔底面积的９０％ ～９８％。高剂量甘草酸处理肿瘤细胞４８ ｈ 时，细胞数量少，间距大，多数细胞体积固缩变小、失去原有肿瘤细胞形态而略呈圆形、椭圆形，说明对肿瘤细胞的生长与增殖具有显著的抑制作用。结果见表１。
表1 甘草酸对4种肿瘤细胞增殖的抑制效应（略）
从表１ 可见甘草酸的抑瘤效果表现出浓度依赖性，与浓度呈正相关关系。高浓度甘草酸（１ ０００ μｇ／ｍｌ）对Ｂｃａｐ －３７，Ｈｅｌａ，ＭＧＣ －８０３ 的增殖均有较强的抑制作用， 其抑制率分别为７６．３７％，７９．７１％，７１．０６％，对Ｂｅｌ －７４０４ 细胞增殖的抑制作用较差，抑制率仅为２４．２９％。
２．２ 甘草黄酮体外抗肿瘤实验结果(见表２)。从表２ 中可得知，甘草黄酮处理肿瘤细胞４８ ｈ 后，在一定浓度范围内（２００ ～１ ０００ μｇ／ｍｌ），其对４ 种肿瘤细胞的抑制率与样本浓度大小呈负相关关系，即样本浓度越低，对肿瘤细胞的抑制率越高，２００ μｇ／ｍｌ 剂量的甘草黄酮抑制肿瘤细胞增殖的效果最佳，其对Ｂｃａｐ －３７，Ｈｅｌａ，Ｂｅｌ －７４０４，ＭＧＣ －８０３ 等４ 种肿瘤细胞增殖的抑制率分别为７９．５５％，７９．９８％，６７．９１％以及３７．８６％；在极低浓度时（１００ μｇ／ｍｌ 的剂量），甘草黄酮对这４ 种肿瘤细胞生长均无明显抑制作用。
表2 甘草黄酮对4种肿瘤细胞增殖的抑制效应（略）
2.3 细胞凋亡实验从图１ ～３ 中可以看到，４ 种肿瘤细胞经荧光染色后，正常细胞的细胞核呈弥散均匀状，凋亡细胞的细胞核由于凋亡致使细胞核固缩成团，在荧光下呈致密浓染或碎块状，颜色较正常细胞更深更亮。甘草活性成分诱导ＢＣＡＰ 细胞凋亡的实验结果见表３。
表3 不同处理对4种肿瘤细胞凋亡的影响（略）
本研究中我们以临床常用肿瘤治疗药物顺铂做阳性对照，从结果中我们可以看出与阴性对照组相比甘草黄酮与甘草酸均具有极显著的诱导４ 种肿瘤细胞凋亡的生物学效应（P＜０．０１），甘草黄酮能很好的诱导人乳腺癌细胞（Ｂｃａｐ －３７）、人宫颈癌细胞（Ｈｅｌａ）以及人肝癌细胞（Ｂｅｌ －７４０４）的凋亡，其效果均优于等剂量的顺铂；而对胃癌细胞凋亡的诱导效果不及顺铂。高浓度（１ ０００ μｇ／ｍｌ）的甘草酸只对人宫颈癌细胞（Ｈｅｌａ）的诱导凋亡效应与２００ μｇ／ｍｌ 的顺铂相当，对其余细胞的诱导凋亡效果均不及顺铂。
图1 阴性对照组（×400）（略）
图2 阳性对照组（×400）（略）
图3 样品处理组（×400）（略）
3 讨论
细胞凋亡是一种与细胞坏死具有不同形态及生化特征，且受基因调控的主动性细胞死亡。与诱导细胞坏死相比，通过诱导细胞凋亡杀死癌细胞不会引起机体强烈的炎症反应［７］ 。因此，通过诱导细胞凋亡来杀伤和清除肿瘤细胞，已经成为一种筛选抗癌药的快速有效的方法。为了探讨甘草活性成分甘草酸、甘草黄酮在抗肿瘤作用中的潜在治疗价值，实验中笔者以人宫颈癌细胞（Ｈｅｌａ）、人乳腺癌细胞（Ｂｃａｐ －３７）、人胃癌细胞（ＭＧＣ －８０３）、人肝癌细胞（Ｂｅｌ －７４０４）为研究对象，以顺铂作为阳性对照（铂类药物具有较强的抗肿瘤活性［８］），观察甘草酸、甘草黄酮对这４种肿瘤细胞的增殖抑制及其诱导凋亡作用。结果显示甘草黄酮类化合物对人宫颈癌细胞（Ｈｅｌａ）、乳腺癌细胞（Ｂｃａｐ －３７）以及肝癌细胞（Ｂｅｌ －７４０４） 的增殖均具有显著的抑制及诱导细胞凋亡的效果；甘草酸只在高浓度条件下才对人胃癌细胞（ＭＧＣ －８０３）显示出较强的抑制增殖作用，其对胃癌细胞（ＭＧＣ －８０３）的诱导凋亡效应不佳（不及顺铂），这与以往的研究结果是一致的［7］。综上所述，甘草酸、甘草黄酮抑制这４ 种肿瘤细胞增殖与诱导其细胞凋亡的结果是相一致的；因此，甘草酸和甘草黄酮诱导细胞凋亡是其显著抑制肿瘤细胞增殖的重要途径。鉴于甘草黄酮类化合物的抑瘤效果优于甘草酸，所以在进行甘草抗癌药物筛选时，应优先考虑甘草黄酮类物质。
【参考文献】
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