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【摘要】 目的优化三棱中甘露醇的微波辅助萃取工艺。方法以甘露醇含量为响应指标，通过均匀试验设计，采用二次响应曲面和通径分析并结合单因素实验优化三棱中甘露醇的微波辅助萃取工艺。结果获得的响应曲面方程在α<0.01的水平上显著，优化的萃取工艺参数为：微波功率1 400 W，辐射时间30 min， 浸泡时间120 min，固液比为1∶6，乙醇浓度为45%，模型预测值的相对误差小于1%。结论获得的响应曲面方程在α<0.01的水平上显著，优化的萃取工艺参数为：微波功率1 400 W，辐射时间30 min， 浸泡时间120 min，固液比为1:6，乙醇浓度为45%，模型预测值的相对误差小于1%。
【关键词】 反相高效液相色谱 甘露醇 超临界萃取 均匀设计
Abstract:Objective To optimize microwave extraction process of mannitol from Sparganium stoloniferum.MethodsGuided by the contents of mannitol in Sparganium stoloniferum, uniform design, response surface analysis and path analysis were used to optimize microwave extraction process by combining with single factor experiment.ResultsObtained response surface equation is notable at the level a<0.01 and the relative error of the predicted value from the model was smaller than 1%. The optimized process was established as following:1400 W as radiation power, 30 min as radiation time, 120 min as dipping time and 6 times as the ratio of solid to solvent and 45% of alcohol as extractor.ConclusionThe established model is quite notable and has quite high prediction precision and the yield of mannitol extracted by the optimized microwave extraction process is the highest as compared with other processes.
Key words:RP-HPLC； Sparganium stoloniferum； Response surface analysis；Uniform design 三棱Sparganium stoloniferum是荆三棱科植物黑三棱的干燥块茎，是常用的活血化淤中药，其有效成分之一甘露醇具有脱水利尿、镇咳、祛痰、平喘、润肠通便、抗凝血及抗血栓、镇痛、提高血浆渗透压［1,2］、清除人体内羟自由基等作用［3］，临床用于治疗中风、冠心病、宫外孕、阑尾周围脓肿及慢性肝炎、慢性盆腔炎等，其和莪术一起使用具有抑制肿瘤的功能［4］，在抗癌中药的配方中起着非常重要的作用，另外甘露醇还用于食品的防黏、糖尿病患者食品、健美食品等低热值、低糖的甜味剂等。论文学术科研网 微波萃取工艺是一种新的提取工艺，具有溶剂用量少、萃取时间短等优点。传统提取工艺的传质和传热方向是由外向内，而微波萃取的传质和传热方向都是由内向外，相对于传统工艺来说，微波萃取工艺更有利于有效物质的溶出，是一种具有较大发展潜力的新的萃取技术［5］。因此本实验采用微波萃取工艺，以甘露醇含量为考察指标，通过均匀设计考察微波功率、微波辐射时间、溶剂用量、溶剂浓度、浸泡时间等参数对提取效果的影响，用二次响应曲面对实验数据进行分析，建立经验模型，优化提取工艺。
1 仪器与材料
南京三乐公司WCD2S-1型微波萃取设备；国华电器HH-4型数显恒温水浴锅。
三棱购自北京同仁堂集团，经北京联合大学生物化学工程学院制药工程研究所林强博士后鉴定；甘露醇对照品（批号100533-200301）购自中国药品生物制品检定所；无水乙醇、高碘酸钾、碘化钾和浓硫酸等 等均为分析纯；本实验用水为超纯水。
2 方法
2.1 三棱中甘露醇的提取方法
2.1.1 乙醇回流提取取三棱药材粉碎，过40目筛，用3倍95%乙醇回流提取3 h，之后趁热抽滤，取滤液得供试品。
2.1.2 超临界流体萃取取三棱药材粉碎，过40目筛，用0.5倍95%乙醇作为改性剂在35 MPa和40°C条件下进行萃取，之后将萃取物乙醇溶解、过滤，取滤液得供试品。
2.1.3 微波辅助萃取采用连续微波照射的微波萃取工艺萃取三棱中甘露醇，之后趁热抽滤，取滤液得供试品。
2.2 均匀设计用表和实验结果采用均匀设计方法，以甘露醇含量为响应指标，以微波辐射功率、辐射时间、浸泡时间、乙醇药材质量比以及乙醇体积浓度为实验因素，每个实验因素安排3～6个水平，采用DPS 6.05专业版软件筛选出的U12（66）混合水平均匀设计表安排实验，实验的因素与水平见表1。表1 均匀设计因素-水平（略）
2.3 甘露醇含量的测定［6］
2.3.1 供试品溶液的测定 精密吸取供试品5 ml置于250 ml三角瓶中，加入碘酸钾溶液50 ml［取浓硫酸(1→20) 90 ml与高碘酸钾液(1 →1 000) 110 ml混合］，置水浴上加热15 min，放至室温，加碘化钾溶液5 ml，放置5 min，用0. 01 mol?L-1硫代硫酸钠溶液滴定，将至终点时加淀粉指示液1 ml，继续滴定至蓝色消失，滴定结果用空白实验校正，每毫升0.01 mol?L-1硫代硫酸钠溶液相当于0. 364 3 mg甘露醇。
? 2.3.2 分析方法的加样回收率实验
采用加样回收法，精密称取6份已知含量的同一供试品溶液于5 ml量瓶中，准确加入甘露醇对照品适量，然后用95%乙醇定容，摇匀，按“2.2.1”项下的方法测定甘露醇含量。测得平均回收率为99.91%，RSD=1.24%。结果见表2。表2 分析方法的加样回收率实验结果（略）
2.3.3 供试品溶液稳定性实验
供试品溶液室温放置，分别于0，2，4，6，24，48 h各进样1次，测定甘露醇含量，RSD=0.37%，说明样品溶液在48 h内稳定。 2.3.4 微波辅助萃取三棱的重现性实验
称取粉碎过筛的干燥三棱粉末100 g，以6倍45%的乙醇浸泡120 min，然后置于微波萃取釜中以1400 W的微波功率辐射30 min；以此条件分别提取6组样品，每组样品平行滴定3次，测定甘露醇含量，RSD=0.23%，微波辅助萃取的重现性良好。
2.4 数据分析方法采用二次响应曲面分析方法，研究各实验因素与考察指标间的关系，建立相应的回归模型，并结合通径分析和响应曲面图对萃取工艺进行优化。
学术科研网 3 结果
3.1 微波萃取、乙醇回流提取、超临界流体萃取三棱的比较以提取物中甘露醇为实验指标，对微波萃取、乙醇回流提取、超临界流体萃取进行了比较。结果如表2所示。
从实验结果可以看出，微波萃取法所得到的产物中甘露醇含量较高，而且还具有萃取时间短等优点，因此本实验选用微波辅助萃取技术对三棱中甘露醇的提取工艺进行研究。表3 微波萃取、乙醇回流提取和超声波提取工艺的提取结果比较（略）
3.2 均匀试验设计及结果三棱生药粉碎、过40目筛，60℃烘干燥6 h，精确称200 g过筛的三棱粉，加入萃取剂，浸泡一定时间，然后置于萃取釜中，按选定的均匀设计表安排实验，实验设计用表及结果见表4。表4 均匀设计用表和实验结果（略）
3.2.1 响应模型测定结果利用数据处理系统DPS 6.05专业版软件进行二次响应曲面进行分析，得到如下模型方程：
Y=-15.4484+2.7520×10-2X3+48.1755X5+7.1829×10-3X22+1.2934X42-20.6636X52+1.1253×10-5X1X2-1.7997×10-3X2X3-4.7531×10-2X2X4+1.1477×10-2X3X5-6.5927X4X5 模型的复相关系数r=0.999 99，F=10 409，方程在α<0.01的水平上显著；其剩余标准差s=0.033，响应模型具有很高的预测精度，预测结果的相对误差不大于1%；另外模型的决定系数为0.999 9，也说明模型方程具有极高的预测精度。因此，用该模型预测萃取工艺参数对三棱中甘露醇的微波辅助萃取结果的影响是可行的。 根据 响应模型，求出最优组合为X1=210 0，X2=30，X3=120，X4=4.5，X5=0.45
3.2.2 响应模型方程的验证在此条件下进行实验得到甘露醇萃取率为13.023 1 mg?g-1（n=3），而模型的预测结果为13.087 7 mg?g-1，模型的相对误差为0.49%，说明模型具有很高的预测精度。
3.2.3 通径分析和响应曲面分析在模型方程中，X1，X4和X5都是均匀设计表中的最大实验水平，这只能说明优化后的结果在本实验确定的实验水平范围内是最佳的，但并不能真正反映实际可能的最优萃取条件，还需要进一步考察微波辐射功率、乙醇体积浓度和乙醇药材质量比对萃取结果的影响，因此本实验对回归结果进行通经分析，得到模型中各项的直接作用系数和间接作用系数（见表5），并做出响应曲面图（见图1）。表5 模型中各项的直接作用和间接作用（略）
由表3可见，进入模型方程的各项的决定系数大小顺序为X5>X42>X4X5>X52>X2X5>X22>X2X4>X3>X3X5>X2X1，X5的决定系数最大，对结果的直接作用最为显著，且呈正向影响，X42对结果的直接作用非常显著，且呈正向影响，X4和X5的交互项以及X52对结果有显著的直接作用，但呈负向影响，而X2X1对结果的影响最小。
另据图1a，随着微波功率的变化，甘露醇萃取率的变化很小，而微波功率增加会增加能耗，且实验中发现在微波功率较高、时间较长、乙醇药材质量比相对较少的情况下，易导致药材炭化，因此易选用1 400 W。 乙醇药材质量比X4对甘露醇提取率的影响见图1b和图1c，虽然乙醇药材质量比X4和辐射时间X2以及乙醇浓度X5都有交互作用，对萃取率的影响却不尽相同，但总体趋势是一致的，即X4越大，甘露醇萃取率越高；而图1c和图1d中，乙醇浓度X5对萃取率的影响呈相反趋势。因此，又进一步以模型优化条件为基础，分别考察了乙醇浓度和乙醇药材质量比等单因素对甘露醇萃取率的影响。
3.2.4 乙醇浓度和乙醇药材质量比对甘露醇萃取率的影响根据模型优化结果，固定X1=1 400，X2=30，X3=120和X4=4.5考察乙醇体积浓度对甘露醇萃取率的影响，结果见图2。图2表明采用45%的乙醇提取时甘露醇萃取率最高。因此本实验选用45%的乙醇作为优化后的乙醇浓度。 固定X1=1 400，X2=30，X3=120和X5=45%考察乙醇和药材质量比对甘露醇萃取率的影响，结果见图3。图3表明随着乙醇用量的增加，甘露醇提取率增大，但当乙醇用量增加到6倍时再继续提高乙醇用量对萃取率影响不大，考虑到乙醇用量的增加会增加乙醇回收成本，因此本实验选用6倍乙醇用量作为最佳的乙醇用量。
因此本实验的最优萃取条件为：X1=1 400，X2=30，X3=120，X4=6.0，X5=0.45。在此条件下进行实验，得到的甘露醇萃取率为118.268 0 mg/g（n=3），高于第1次优化结果，因此确定三棱微波辅助萃取甘露醇的最优化条件为：X1=1 400，X2=30，X3=120，X4=6.0，X5=0.45。
4 讨论
采用均匀设计方法、利用通径分析和响应曲面方法对微波辅助萃取三棱中甘露醇的工艺优化进行了研究，得到的响应方程在α<0.01的水平上显著，求出的最优组合为X1=2100，X2=30，X3=120，X4=4.5，X5=0.45，模型预测的相对误差为0.49%，说明模型具有很高的预测精度。
在通径分析和响应曲面分析的基础上，结合单因素实验得到的最优工艺参数为X1=1 400，X2=30，X3=120，X4=6.0，X5=0.45，在该工艺条件下进行三棱的微波辅助萃取，可以得到更高的甘露醇萃取率。
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