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【摘要】 目的建立高效液相色谱法测定青蒿中山柰素的含量，并对青蒿不同部位的山柰素含量进行比较。方法岛津VP??ODS色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-0.2%磷酸溶液（35∶65）为流动相，测定波长367 nm，柱温30℃，流速0.8 ml/min，进样量20 μl。结果山柰素在0.0218～0.436μg范围内呈现良好的线性关系（r=0.999 9），平均回收率为98.70%，RSD为1.20%。结论该方法简便可行，重复性好，专属性强，可用于青蒿中山柰素的含量测定。测定结果表明，青蒿叶中山柰素的含量最高，花次之，根较少，茎最低。论文学术科研网
【关键词】 高效液相色谱法； 青蒿； 山柰素
Abstract：ObjectiveTo establish HPLC method for the determination of kaempferol in Qinghao and analyze kaempferol content in different parts of Qinghao. MethodsKaempferol in Qinghao was determined by HPLC with VP-ODS column (150 mm×4.6 mm, 5μm). The mobile phase was Acetonitrile-0.2%H3PO4（35∶65） solution. The detection wavelength was 367nm. The column temperatare was 30℃, the flow rate was 0.8 ml/min,and the sampling volume was 20μl. ResultsLinearity of Kaempferol was good(r＝0.999 9) in range of 0.0218～0.436μg. The average recovery was 98.70%，RSD was 1.20%. ConclusionThe method is simple，accurate，repeatable and suitable for the determination of kaempferol in Qinghao. The results show that the highest content of Kaempferol is in leaf，flowers the second，less roots，stems the minimum.
Key words：HPLC; Qinghao; Kaempferol
青蒿为传统清热解暑要药，来源于菊科蒿属植物黄花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分［1］，性味苦寒，归肝、胆、肾经，具清热、祛暑、除蒸、截疟等功效，临床上主要用于治疗阴虚发热、暑热外感、疟疾、湿热黄疸诸证。青蒿药用历史悠久，全国各地均有分布。古代本草记载中除有青蒿地上部分供药用外，还有青蒿根的药用记录 ［2］；民间验方中亦有使用青蒿根治疗多种疾病的情况。因此，青蒿这味因青蒿素而备受人们关注的药迫切需要我们的深入研究，拓展其药用价值。
青蒿的化学成分种类较多，主要含有挥发油、倍半萜内酯类、黄酮类、香豆素类等。目前，青蒿中的挥发油、青蒿素和香豆素类成分如东莨菪内酯等［3］均有其成分分析和含量测定的报道，但是，黄酮类成分的相关报道却未曾见过。山柰素为青蒿中黄酮类化合物之一，具有抗癌［4］、抗炎等药理活性，能反映青蒿的部分功效，因此，可作为一个指标成分进行分析。本文首次建立了青蒿中山柰素的高效液相色谱（HPLC）含量测定方法，并对青蒿不同部位（叶、花、根、茎）的山柰素含量进行分析和比较，为青蒿药材和制剂的质量控制提供参考。
1 仪器与试药
岛津（SPD-10A，LC-10AT）高效液相色谱仪；UV1100紫外－可见分光光度计。山柰素对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用）；乙腈、甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。
青蒿药材采自四川省安岳县青蒿基地，经笔者鉴定为菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.的干燥全株。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：岛津VP-ODS（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈－0.2%磷酸溶液（35:65）；测定波长367 nm；流速0.8 ml/min；柱温30℃；进样量：20 μl。在该条件下，山柰素色谱峰 峰与相邻色谱峰达到基线分离，分离度大于1.5，理论塔板数（N）按山柰素峰计算为4 000以上。对照品和样品色谱图见图1。
2.2 线性范围的考察 精密称取山柰素对照品适量，加甲醇制成每毫升含山柰素0.02 mg的溶液，即得。将上述对照品溶液制成一系列不同浓度的对照品溶液，分别进样20 μl，按上述色谱条件测定其峰面积。以山柰素进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，求得标准曲线的回归方程为：Y＝5 00 0 000X－98 335，R＝0.999 9。结果表明，山柰素在0.021 8～0.436 μg范围内呈良好线性关系。
2.3 供试品溶液的制备取青蒿药材粉末1.0 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，置水浴锅中加热回流60 min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液25 ml，加5 ml 25%盐酸，水浴回流30 min,迅速冷却至室温，移置50 ml容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。
学术科研网 2.4 精密度实验精密吸取对照品溶液20 μl，连续进样6次，依法测定，记录峰面积，RSD为 0.80%。
2.5 重复性实验取同批药材6份，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，依法测定，记录峰面积，计算山柰素的含量，平均含量为0.675 1 mg/g ，RSD为1.14%。
a-山柰素对照品 b-青蒿样品
图1 HPLC色谱图
2.6 稳定性实验
2.6.1 对照品溶液的稳定性实验精密量取山柰素对照品溶液，分别于0，5，10，15，20，25 h进样20 μl，测得山柰素峰面积值，RSD为0.92%。表明对照品溶液在25 h内稳定。
2.6.2 供试品溶液的稳定性实验取青蒿全株粉末1.0 g，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，分别于0，5，10，15，20，25 h进样20 μl，测得样品中山柰素峰面积值，RSD为1.13%。表明供试品溶液在25 h内稳定。
2.7 加样回收率实验取已知含量的青蒿全株样品粉末9份，每份约0.5 g，精密称定，分别加入山柰素对照品（21.8μg/ml）10，15，20 ml，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，并依法测定。计算回收率，结果山柰素的平均回收率为98.70%，RSD为1.20%。3种水平9次实验的加样回收率测得结果均在95%～105%之间，说明山柰素的提取和检测方法可行。
2.8 样品测定分别吸取对照品溶液和青蒿不同部位（叶、花、根、茎）的供试品溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，并计算山柰素的含量。结果见表1。
3 讨论
通过紫外分光光度计对山柰素对照品的甲醇溶液，在200～400 nm波长范围内进行扫描。结果发现，山柰素在215，268及367 nm处均有吸收峰，由于215 nm接近溶剂末端吸收，干扰较大，268 nm波长下干扰峰较多，分离度较差，而在367 nm处灵敏度高，杂质干扰小，最后选择367 nm为含量测定的检测波长。
实验中参考相关文献［5～8］，考察了供试品溶液制备方法，比较了不同提取方法、不同提取溶剂、不同提取时间、不同溶剂体积，最后确定以甲醇回流提取效果较好。青蒿中的黄酮类化合物以苷元及苷的形式存在，因此，本实验采用酸水解后，再测定苷元的含量。表1 青蒿的叶、花、根、茎含量测定结果
色谱条件考察时，比较了不同比例的甲醇－0.2%磷酸溶液，结果样品峰分离度均较差。经过多次试验摸索，最终确定以乙腈－0.2%磷酸溶液（35∶65）作为含量测定的流动相，在该条件下得到的色谱峰峰形尖锐，分离度高。
本文首次建立了青蒿中山柰素的HPLC含量测定方法，并且进行了方法学考察，结果显示该方法准确度高、专属性强、灵敏度及稳定性均较好，测定方法可靠，测定结果能客观反映青蒿药材中山柰素的含量。由该方法下测定的结果可见，青蒿叶中山柰素含量最高，花次之，根较少，茎最低。
山柰素为青蒿中黄酮类成分之一，对其含量测定方法的研究，丰富了青蒿除青蒿素外其它有效成分研究的内容，为青蒿药材的开发利用提供了科学依据。本文仅对青蒿中的一种黄酮类成分进行了研究，今后还应进一步对其化学成分、药理作用等进行全面的研究，为青蒿的系统开发奠定基础。
【参考文献】 ［1］ 国家药典委员会． 中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：137．
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