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作者：张孝勇，崔光彬，杜滂，马克军，王亚蓉，韩苇，颜真，张英起，魏经国
【摘要】 目的：克隆新西兰白兔大电导钙敏感性钾离子通道(BKCa)β亚基基因，观察其组织分布，并对其进行生物信息学分析. 方法：采用3′及5′cDNA末端快速扩增(RACE)及RT??PCR技术从兔Oddi括约肌(SO)组织获得BKCa通道β亚基的全长cDNA序列. 并应用生物信息学方法分析该基因的同源性、蛋白结构域及跨膜拓扑结构. 结果：兔BKCa通道β亚基基因cDNA全长为1168 bp，开放读窗长度为576 bp，编码191个氨基酸. 生物信息学分析表明该基因核酸序列及氨基酸序列与人类及其它哺乳动物有很高的同源性；拓扑结构为两次跨膜蛋白，具有4个功能结构域，含有1个磷酸化位点及2个N?蔡腔?化位点. 结论：首次成功地从兔SO组织克隆出BKCa通道β亚基基因，获得新GenBank号 DQ821756，为进一步研究该基因的功能奠定了基础.
【关键词】 钙敏感性钾离子通道
0引言
大电导钙敏感性钾离子通道(large conductance Ca2+ sensitive K+ channels, BKCa)广泛分布于平滑肌细胞(SMC)，其主要生理作用是调节SMC膜电位和肌张力［1］. BKCa通道是由α亚基和β亚基共同组成，其中α亚基是结构亚基，构成孔道，表达量较恒定；β亚基是调节亚基，可提高通道对钙离子的敏感性，表达量的高低同该通道的功能状态密切相关［2］. 但目前GenBank尚未发布兔BKCa通道β亚基的基因序列，因此获得这段基因序列成为下一步研究的关键. 我们根据已知新西兰白兔部分组织BKCa通道β亚基保守区序列(GenBank Number: AB009313, AF107300, AY829265)设计引物，直接体外扩增兔Oddi括约肌(sphincter of Oddi, SO)细胞BKCa通道β亚基基因的cDNA全长序列，并采用生物信息学方法对该基因的特征进行分析.
1材料和方法
1.1材料新西兰白兔8只， 雌雄不拘， 体质量2.0～2.5 kg（第四军医大学实验动物中心）； Trizol RNA抽提试剂（Invitrogen公司）；3′及5′ RACE试剂盒First Choice?k RLM??RACE Kit（美国Ambion公司）；DNA Marker，RT??PCR Kit，T4 DNA连接酶，Taq酶，pMD18??T载体，限制性内切酶等（大连TaKaRa公司）；IPTG，X??gal（北京鼎国生物技术公司）；琼脂糖凝胶回收试剂盒及产物纯化试剂盒（上海博亚生物技术公司）；PCR仪（美国Bio??Rad公司）；寡核苷酸引物合成及测序由北京三博生物技术公司完成.
1.2方法
1.2.1兔SO细胞总RNA的提取经兔耳缘静脉快速注入约10 mL空气将兔处死，快速锐性无菌分离SO段，取出后用4℃生理盐水冲洗. 于解剖显微镜下刮除浆膜及结缔组织，纵形切开SO段，刮去黏膜组织，用组织剪将其剪成约100 mg小块，加入4℃ Trizol 1 mL中. 使用高速组织匀浆机将组织块完全粉碎后，4℃离心10 min，弃沉淀，将上清转移至新的1 mL离心管中. 按照Trizol一步法取试剂盒说明进行RNA的提取. 抽提出的RNA经凝胶电泳鉴定RNA质量，于紫外分光光度计260 nm和280 nm处鉴定RNA的纯度及浓度.
1.2.23′及5′ cDNA末端快速扩增（RACE）严格按照试剂盒说明书操作，所采用引物见表1. 5′ RACE的主要步骤及反应条件：① 1 μg总RNA经CIP和TAP处理；②连接5′ RACE接头；③ 5′ RACE ready??cDNA；④巢氏PCR扩增：以5′ Race ready??cDNA为模板，以试剂盒提供的5′ RACE Outer Primer和5′ RACE Inner Primer为上游引物，在序列保守区设计了2条下游引物5OGP和5IGP. 5′ RACE第1轮PCR反应采用引物5OP和5OGP，反应条件为: 94℃ 3 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 7 min. 取第1轮PCR产物2 mL进行第2轮PCR反应，引物为5IP和5IGP，反应条件为: 94℃ 1 min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min. 3′ RACE的主要步骤及反应条件： ① 3′ RACE ready??cDNA；②巢氏PCR扩增：以3′ RACE ready cDNA为模板， ，以试剂盒提供的3′ RACE Outer Primer和3′ RACE Inner Primer为上游引物，在序列保守区设计了2条上游引物3OGP和3IGP. 3′ RACE第1轮PCR反应采用引物3OP和3OGP，反应条件为: 94℃ 3 min；94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环；72℃ 7 min. 取第1轮PCR产物2 mL进行第2轮PCR反应，引物为3IP和3IGP，反应条件为: 94℃ 1 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min.
1.2.3RT??PCR 扩增BKCa通道β亚基cDNA序列全长提取兔SO组织的总RNA，使用Reverse Transcriptase M??MLV，以总RNA为模板，以Oligo dT为随机引物，分别将各种组织的总RNA逆转录成cDNA. 然后进行PCR扩增，反应体系为50 mL；引物设计参照3′和5′ RACE测序结果，上下游引物分别为RUP和RLP（表1），反应条件为：94℃ 1 min；94℃ 30 s, 68℃ 30 s, 72℃ 90s, 36个循环；72℃ 10 min.
? 表1本实验用到的引物序列 略
1.2.4扩增产物的克隆测序PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶上电泳与DNA marker比较判断产物的大小，PCR扩增产物经回收纯化，与pMD18??T载体相连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，转化的菌液铺制在IPTG和X??gal的Amp阳性LB平板上，通过蓝白筛选挑选单克隆菌落，按常规方法提取质粒，并用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，鉴定正确克隆送北京三博远志公司测序.
1.2.5生物信息学分析基因序列同源性分析登陆美国国家生物技术信息中心(NCBI)，使用Blastn在核酸数据库中对BKCa通道β亚基的核酸序列进行同源性比对；使用Blastp在蛋白质数据库中对BKCa通道β亚基编码的氨基酸序列进行同源性比对. 使用保守序列数据库(CDD)寻找β亚基编码氨基酸序列是否和已知保守序列相关，在线对兔(Rabbit), 人类(Homo sapiens), 猕猴(Macaca mulatta), 黑猩猩(Pan troglodytes), 大鼠(Rattus norvegicus), 小鼠(Mus musculus), 家犬(Canis)和牛(Bos Taurus)的该基因序列进行同源分析. 并采用蛋白分析专家系统ExPASy的Protein knowledgebase (UniProtKB/Swiss??Prot)数据库、在线软件TMHMM Server v.2.0 ( http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 预测该蛋白的结构域及膜蛋白拓扑结构.
2结果
2.15′ RACE扩增以正常新西兰白兔SO组织总RNA为模板，经5′ RACE扩增，产物以10 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增条带大小约为600 bp (图1). 经克隆测序，测序结果与GenBank中该基因的部分保守区序列完全一致.
论文参考网
图1BKCa通道β亚基5′ RACE扩增结果 略
2.23′ RACE扩增以正常新西兰白兔SO组织总RNA为模板，经3′ RACE扩增，产物以10 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析为单一扩增条带，大小约为850 bp(图2). 经克隆测序，测序结果与GenBank中该基因的部分保守区序列完全一致.
图2BKCa通道β亚基3′ RACE 扩增结果 略
2.3RT??PCR扩增BKCa通道β亚基cDNA序列全长从正常新西兰白兔SO组织中提取总RNA，经RT??PCR扩增，产物以10 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析为单一扩增条带，大小约为1200 bp(图3). 经克隆测序，cDNA长度为1168 bp，3′及5′端测序结果与RACE测序结果完全一致.
图3BKCa通道β亚基cDNA全长序列扩增结果 略
2.4生物信息学分析
2.4.1同源性比对新西兰白兔SO细胞BKCa通道β亚基的cDNA序列总长度为1168 bp，由4个外显子拼接而成，其长度分别是154，158，172，655 bp. 其中Exon1不编码，从Exon2的第25位碱基开始编码，ORF长度为576 bp，编码191个氨基酸. 通过NCBI核酸同源程序Blastn及蛋白同源程序Blastp分析表明，兔的不同组织间该基因编码区核酸及氨基酸序列的同源性为100%；cDNA全长序列与兔脑、 骨骼肌、肾脏连接管和主动脉组织该亚基cDNA序列一致性分别为99%，98%，97%，99%. 通过与人类等其它哺乳动物的同源比对，其编码区核酸及氨基酸序列的一致性如表2所示，可见BKCa通道β亚基基因在种属间具有很高的一致性.
表2兔BKCa通道β亚基与其他种属的同源性比对 略
2.4.2蛋白结构域预测经ExPASy中的UniProtKB/Swiss??Prot数据库分析显示，该蛋白有4个功能结构域，分别位于第8~20，35~48，78~91及93~107位氨基酸（图4）. 第14位苏氨酸T为可能的蛋白激酶A(PKA)磷酸化位点；第80位及142位天冬酰胺为可能的N?蔡腔?化位点.
图4兔SO细胞BKCa通道β亚基氨基酸序列功能结构域预测 略
2.4.3跨膜结构预测在线蛋白结构拓扑分析软件TMHMM Server v. 2.0预测显示，该亚基有两个跨膜区，分别位于第16~36位氨基酸和158~178位氨基酸区，第2外显子部分氨基酸构成第1跨膜段，第3外显子全部位于细胞外，第4外显子的部分氨基酸构成第2跨膜段. 该蛋白的N?材┒撕?C?材┒司?在细胞内（图5）.
图5兔SO细胞BKCa通道β亚基的跨膜结构示意图 略
3讨论
β亚基是BKCa通道的调节亚基，通过感受［Ca2+］i及电压的变化调控BKCa的动力学特性，在调控细胞膜电位及肌张力过程中对细胞膜的极化状态起负反馈调节作用［3］. 我们前期的研究发现高胆固醇条件下，兔SO细胞［Ca2+］i呈过载状态［4］，进一步研究发现高胆固醇血症兔的BKCa通道活性降低［5］. 由于β亚基是BKCa通道的调节亚基，对调节［Ca2+］i起重要作用. 我们采用快速、灵敏的RACE［6］技术扩增兔SO组织BKCa通道β亚基序列，该技术从操作及引物设计上都有一定难度，在实验中我们先是根据其同源序列设计简并引物，反复进行RT??PCR预实验以提高PCR扩增的特异性，然后在PCR条件优化的基础上进行RACE实验，最终经RT??PCR扩增得到这段基因序列(GenBank number: DQ821756, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=110087063).
生物信息学分析表明兔SO组织BKCa通道β亚基基因cDNA全长为1168 bp，开放读框位于第179~752位核苷酸序列， 编码191个氨基酸， 同兔其他组织该基因的cDNA相比较组织造成的特异性几乎不存在，他们编码的氨基酸序列完全一致. 测序结果显示，该基因5′端的核苷酸数目和GenBank中已有的兔其他组织该基因β亚基cDNA相比分别长了92~160个碱基. 而3′端在终止密码子后有加尾信号和长的polyA尾. 非编码区仅有少数碱基的突变. 这些特点符合基因全长cDNA序列结构的特点. 同源性分析显示该基因与人类、猕猴、黑猩猩、大鼠、小鼠、家犬和牛等哺乳动物的核苷酸序列及氨基酸序列都具有很高的同源性，说明该基因序列十分保守［7］. 进一步分析显示该亚基属于膜蛋白，具有两个跨膜螺旋区，N端没有信号肽存在，由位于胞内的C末端和N末端以及一个长的胞外段组成. 该亚基存在有4个结构功能域，并且有1个蛋白激酶A(PKA)磷酸化位点及2个可能的N?蔡腔?化位点. 这些性质和GenBank中兔的其他组织的β亚基的分析结果完全相似［8］.
总之，我们采用cDNA末端快速扩增及RT??PCR技术首次从兔SO细胞扩增出BKCa通道β亚基全长cDNA序列，并采用生物信息学的方法分析了其种属间的同源性，预测了该基因的各种功能结构域，为进一步研究该基因的功能和调控奠定了基础.
【参考文献】
［1］ Martens JR, Gelband CH. Ion channels in vascular smooth muscle: alterations in essential hypertension ［J］. Proc Soc Exp Biol Med, 1998, 218(3):192-203.
［2］ Kotlikoff M, Hall I. Hypertension: beta testing［J］. J Clin Invest, 2003,112 (5):654-656.
［3］ Nari K, Joonyong C, Euiyong K, et al. Changes in the Ca2+??activated K+ channels of the coronary artery during left ventricular hypertrophy［J］. Circ Res, 2003, 93(6):541-547.
［4］ Wang XJ, Wei JG, Wang YC, et al. Effect of cholesterol liposome on contractility of rabbit Oddi?? sphincter smooth muscle cells［J］. World J Gastroenterol, 2002, 8(1):144-149.
［5］ 张孝勇，魏经国，马进，等. 高胆固醇血症兔Oddi括约肌张力的变化机制［J］. 世界华人消化杂志，2004, 12(5): 1114-1118.
［6］ Chen Z, Kai G, Liu X, et al. cDNA cloning and characterization of a mannose??binding lectin from Zingiber officinale Roscoe (ginger) rhizomes［J］. J Biosci, 2005,30(2):213-220.
［7］ Jiang Z, Wallner M, Meera P, et al. Human and rodent MaxiK channel beta??subunit genes: Cloning and characterization［J］.Genomics,1999,55(1):57-67.
［8］ Deutsch C. Potassium channel ontogeny［J］. Annu Rev Physiol, 2002, 64:19-46.