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【关键词】 聚合酶链反应；,,酶联免疫吸附测定；,,基因定量；,,HIV
Establishment of a quantitative PCRELISA detection system with double internal standard
【Abstract】 AIM: To establish a quantitative PCRELISA detection system with double internal standard. METHODS: We designed one pair of primers (downstream primer was modified with DIG at its 5′ end) to amplify a fragment in HIV1 gag region and 2 samelength mutant fragments as internal standard, respectively. Then we designed 3 capture probes (they were modified with Biotin at its 5′ end) which could be hybridized with those 3 competitive PCR products respectively. We amplified the 3 templates of known amount and different concentrations at the same efficiency and in the same tube. Since they were marked, we could analyze them by ELISA and calculate the DNA copies of HIV1 per volume in each sample by formula. RESULTS: There was a fine linear relationship between the copies of HIV1 in fact and in the calculation through formula, with the correlation coefficient being 0.9998, the coefficient of variability being 9.48% in groups,and the error in average being 12.58%. No nonspecific amplification was observed. CONCLUSION: A quantitative PCRELISA detection system with double internal standard has been established successfully. The method is specific, sensitive and in low cost for clinical application.
【Keywords】 PCR； ELISA； gene quantification； HIV1
【摘要】 目的：建立双内标PCRELISA定量检测方法，并进行标定评价. 方法：制备了两种与HIV1野生扩增片段等长的PCR 内参照HS和LS，设计了一对HIV1 基因组gag区基因扩增引物,下游引物的5′端用地高辛修饰,可同时扩增115 bp左右的野生型和两种内参照片段. 设计三套捕获探针，其5′端用生物素（Biotin）修饰，可分别与竞争PCR 产物中的野生片段和两种突变型片段杂交. 同一反应管内,加入已知量但不同浓度的两种内参照及待测HIV1 DNA标准品, 它们将以相同的效率在同一个PCR管内被同时扩增并标记,酶联杂交法进行产物分析，结果用公式计算得出每单位体积待测标本中HIV1的DNA含量. 结果：公式计算出的HIV1拷贝数与实验加入的HIV1拷贝数这两组变量具有良好的线性关系，相关系数0.9998，批内变异系数9.48％，结果误差平均在12.58％,无非特异性扩增. 结论：建立了双内标PCRELISA定量检测方法，该方法具有特异、灵敏、成本低等特点，利于在临床实验上推广.
【关键词】 聚合酶链反应； 酶联免疫吸附测定； 基因定量； HIV1
0 引言
PCR技术已经十分普及，但是其自身具有的高灵敏度的特点使得实验中常常出现假阳性［1］. 酶联免疫吸附试验（enzymelink ked immunosorbent assay, ELISA）法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定等特点. 融合了二者优点的PCRELISA被广泛应用于临床检测领域，作为定量实验的效果很好［2］. 我们以HIV1前病毒的检测为模型，通过改进，建立了PCRELISA双内标（double internal standard）定量检测方法.
1 材料和方法
1.1材料
商品化的链亲和素（Avidin）预包被的96孔微孔检测板（Pierce公司，Cat. No. 15500）；10×PCR buffer，dNTP mix，MgCl2（Promega公司）；Taq酶由本室自制；AntiDIGPOD （Roche公司，Cat. No. 1207733）；显色底物TMB（Sigma公司）；GeneQuant pro微量紫外分光光度计（Amersham公司）；TGRADIENT PCR仪（Biometra公司）；Elx800型酶标仪（BioTek公司）；健康人血样6例、非HIV感染血样30例（甲肝、乙肝、单纯苞疹病毒、巨细胞病毒等）取自福州市第二医院；HIV感染血样4例取自福建省卫生防疫站.
1.2方法
1.2.1引物和探针的设计与合成设计
HIV1特异性引物，上游(5′ataatccacctatcccagtaggagaaat3′)，下游(5′tttggtccttgtcttatgtccagaatgc3′)，扩增出序列为115 bp的gag基因的高度保守序列［3-4］ (表1)，下游引物5′端用地高辛修饰. 设计竞争性高标模板(high standard, HS)与低标模板(low standard, LS)，其与HIV1模板在引物区的序列相同，长度分别为115 bp和116 bp，GC含量, Tm值与HIV1目的片段的参数基本一致. 三种模板分别连接到pUC18载体，经EcoR I 酶切线性化. 设计与HIV1,HS,LS序列中间互补的41 base长度的单链DNA探针，分别记为探针w，h和l, 其5′端标记上生物素（Biotin）(由上海生工公司合成).表1三种模板的参数（略）
1.2.2标准溶液的配制
先用微量?外分光光度计GeneQuant pro对三种经酶切线性化的模板进行精确定量，再由各自的分子质量得知其每μL模板溶液中的拷贝数. 用微量移液枪对上述三种模板分别进行连续10倍倍比稀释到目的DNA浓度为每μL 100拷贝和1000拷贝备用.
1.2.3双温竞争
PCR在0.2 mL 薄壁PCR反应管内,每管加入PCR反应混合液12 μL（5 μL 10×PCR buffer，1 μL 10 mmol/L的dNTP，6 μL 25 mmol/L的MgCl2，各1 μL的上、下游引物）,按不同实验要求加入所需的各种模板，Taq酶5 U（本室自制），加ddH2O,使终体积为50 μL. 经本室优化后的PCR 扩增参数如下: 95℃, 5 min后; 94℃, 30 s; 56℃, 1 min共33个循环（由本室前期实验确定其未达到平台期），再72℃延伸3 min.
1.2.4微孔板酶联杂交定量
以HIV1的起始拷贝数做一梯度实验，即分5个实验组，每PCR管中HIV1拷贝数分别为500，1000，2000，5000，7000，每组做3个平行的PCR管，每管中HS为10 000拷贝，LS为50拷贝. 每PCR管各取10 μL到3个变性试管，于95℃ 10 min解链，马上置于0℃冰盒上猝冷. 各加入200 μL含110 pmol的探针w，h，l，混匀后转移到96孔板的3个检测孔中，55℃保温1 h. 将保温后的溶液甩干，每孔用300 μL的洗涤液洗5次，3 min/次，弃液，拍干. 加AntiDIGPOD后温育30 min，每孔用300 μL的洗涤液洗涤，重复5次，加入显色液，10 min后用50 μL的2 mol/L H2SO4终止反应［5］. 酶标仪测A450 nm值，参照波长为630 nm.
1.2.5野生型模板初始量的确定方法
依据三种模板起始拷贝数与其对应探针最终检测的A值成正比推导出公式：计算出的拷贝数Y=10X, X=lg(L0)+( lg (H0)- lg (L0))×(W-L)/(H-L)，其中X为计算出拷贝数的对数，L0为实验中每管加入的LS的拷贝数，H0为实验中每管加入的HS的拷贝数，W， H， L分别为同一PCR管的等量PCR产物分别用探针w，h和l杂交后测出的A450 nm值. 取每组3个拷贝数的平均 值进行作图(图1). 回归方程式Y=0.8763X+56.785，R2=0.9998，R2为相关系数.
2 结果
2.1灵敏度
在几个PCR管中加入LS模板分别为1，3，5，10，20，50拷贝，利用低标探针l进行PCRELISA检测，重复3次实验，结果只有≥5拷贝的组检测出来的值是阳性. 因此本实验最低检测量为5拷贝的目的片段（相当于14 fg）. 由于本实验利用连续倍比稀释法对PCR模板进行稀释，稀释多次后容易造成较大的误差，因此把LS定在每个PCR反应50拷贝.
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2.2检测容量确定
在初始模板为10 000拷贝时的差异度最小（1.35％），且8000～10 000拷贝起始量结果有较好的线性关系. 因此，我们将每个PCR反应10 000拷贝定为HS的量.
2.3稳定性分析实验得出批内差异为9.48％.
2.4双内标PCRELISA定量检测分析
合成的三种探针经前期PCRELISA检测，未发现交叉反应. 将已经精确定量、分别为500,1000,2000,5000,7000拷贝的HIV1模板与50拷贝LS，10 000拷贝HS竞争性模板加入同一个PCR管进行扩增并标记. 实验测出三种探针ELISA检测的A值，代入公式计算（表2）. 以实验加入HIV1拷贝数为横坐标，公式计算出来拷贝数为纵坐标，做出标准曲线(图1). 用最小二乘法进行拟合线性模型，线性回归方程的相关系数R2=0.9998，说明公式计算出的HIV1拷贝数与实验加入的HIV1拷贝数这两组变量具有显著的线性关系，其关系用图1中的线性回归方程体现. 在HIV1模板拷贝数较小时（<500拷贝/PCR管）表现出较大的误差. 在误差最小时与已知标准仅差了11.204％（标准在2000拷贝时），平均误差在12.58％.表2双内标PCRELISA定量检测分析结果(略)
2.5特异性检测进行PCRELISA检测，结果均无非特异性扩增.
3 讨论
常规PCR方法30个循环一般需要2～3 h，本实验中所涉及的PCR反应除去引物部分，扩增片段仅60 bp左右，采用“双温法”PCR（94℃变性，50～57℃退火并延伸）可以将反应时间缩短在1 h之内，利用双温PCR法能大大缩短PCR扩增的时间，并且能产生与三步法PCR同样多的产物,有利于在稳定有效的Taq酶活性范围时间内完成反应，从而达到稳定实验结果的目的［6］. 本实验最低检出量为5拷贝，与国内检测水平相近［7］. 在一个PCR体系内，目的片段一般不会超过1012拷贝，即1.66 pmol/L［8］. 实验中采用的110 pM远大于检测产物的量，因此是符合实验条件的.
是否设置内参以及恰当的设置是衡量PCRELISA定量效果的一个重要标准. 由于本实验设有两个内参，因此批间差异有可能在内参标准的校正下不影响实验结果. 无内标的PCRELISA只能对目的DNA做定性分析，定量则需在实验中加入内标. 以往国内定量PCRELISA的研究中通常使用单内标方法，但其结果是不同浓度组之间的批间和批内差异都比较大，平均误差在36％左右［9］，如果PCR单一内参照和待测模板起始量相差太大容易造成结果判断不准确. 本实验得出批内差异为9.48％，和国内相关部门所测的9.1％［9］的结果相近. 本实验所采用的双内标法PCRELISA检测目标DNA，因为浓度一高一低的两个内标把PCR管中目的HIV1片段浓度的可模拟范围扩大了. 将已经精确定量、处于50～10 000拷贝之间的HIV1片段与50拷贝LS, 10 000拷贝HS竞争性模板加入同一个PCR管进行扩增，它们将以相同的效率在同一个PCR管内被同时扩增并标记，由于在PCR扩增反应中使用了2个已知浓度内标模板，因此在PCR反应进行过程中每一个PCR反应的试管中任何可能存在的抑制作用和扩增效率都被严密地检测.
检测结果表明，我们设计的检测体系能比较准确的测定出初始拷贝在500～7000拷贝的HIV1的拷贝数，如果大于7000拷贝可以将样品进行稀释，小于500拷贝则无法进行精确测定，这点和我们所查国外相关书籍［10］所述类似. 本方法对HIV感染的血样特异性很高，相同拷贝数的检测重复性比较高，但精确度有待提高，特别是对较低拷贝数样本的定量检测出现一些偏离. 由于样本浓度较低，本实验利用连续倍比稀释法对样品进行稀释的过程难免有些误差，这也许就造成了在较低拷贝数的组偏差较大，影响了实验结果的判定. 可以预计，精确浓度的HS，LS标准品的产生将大大提高本实验的精度.
本实验
利用PCRELISA对HIV1前病毒进行定量检测，其结果为医护人员检出处于HIV感染“窗口期”的患者提供了极大的帮助，也可为患者阶段性用药的效果进行判定. 推而广之，利用该技术可以对其它如乙肝病毒等多种逆转录病毒的前病毒DNA进行定量检测，在临床上有广泛的应用前景.
【参考文献】
［1］Gilliland G, Perrin S, Blanchard K, et al. Analysis of cytokine mRNA and DNA: Detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87(7): 2725-2729.
［2］Diviacco S, Norio P, Zentilin L, et al. A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by coamplification of competitive templates［J］. Gene,1992, 122(2):313-320.
［3］Ou CY, Kwok S, Mitchell SW, et al. DNA amplification for direct detection of HIV1 in DNA of peripheral blood mononuclear cells［J］. Science,1988,239(4837):295-297.
［4］Korber B, Foley CK. Human retrovirus and AIDS: A compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences［M］. Los Alamos, New Mexico:Los Alamos National Laboratory,1996.
［5］郭晏海, 焦凯, 赵锦荣,等. 不对称PCR杂交显色方法的建立及其对HBV DNA的检测［J］. 第四军医大学学报, 1999, 20(9): 827-829.
［6］Dodson LA, Kant JA. Twotemperature PCR and heteroduplex detection: Application to rapid cystic fibrosis screening［J］. Mol Cell Probes,1991,5(1):21-25.
［7］郭晏海, 钟咏梅, 赵锦荣,等. PCRELISA检测TB DNA方法的建立及其初步应用［J］. 第四军医大学学报, 2002,23(22):2086-2088.
［8］Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning:A laboratory manual［M］. 3ed. Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2002.
［9］缪晓辉, 戚中田, 孔宪涛. 微量酶联杂交法定量检测HBV基因竞争PCR扩增产物［J］. 中华微生物学和免疫学杂志, 2001, 21(01): 101-104.
［10］Francois M. Comparison of competitive PCR and positive controlbased PCR. In: B.Kochanowski and Reischl U, editor. Quantitative PCR protocols［M］. Totowa,New Jersey:Humana Press, 1999:110-111