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作者：崔升淼，赵春顺， 何仲贵
【摘要】 目的建立准确、灵敏、可靠的葛根素高效液相色谱（HPLC）测定方法，研究葛根素是否存在分肠段吸收的差异并考察肠上皮组织上的p-糖蛋白（P-glycoprotein）对葛根素吸收的影响。方法在不同肠段（空肠、回肠和结肠）的肠管外翻模型中加入葛根素Krebs液，在不同时间点取样并测定囊内药物浓度，比较不同肠段对葛根素通透能力的差异，同时观察p-糖蛋白抑制剂地高辛和维拉帕米对葛根素吸收的影响。结果葛根素在空肠、回肠和结肠的吸收均具有自身浓度抑制作用。随着p-糖蛋白抑制剂地高辛和维拉帕米浓度的增大，葛根素的肠黏膜透过性增强，当浓度分别达到50 mg?L-1和200 mg?L-1时，这种作用具有一定的饱和性。结论葛根素在各肠段的吸收有可能存在主动转运的过程，葛根素是p-糖蛋白的底物。论文学术科研网
【关键词】 葛根素； 肠管外翻模型； 吸收； 维拉帕米； 地高辛)
Abstract：ObjectiveTo develop an accurate, sensitive and reliable HPLC method for puerarin, and to study the absorption characteristics of puerarin in different intestinal sections (jejunum, ileum and colon) and the influence of p-glycoprotein on the absorption rate.MethodsRat everted gut sac was used. Sac containing drug free Krebs solution was immersed into the Krebs solution containing puerarin. The solution inside the sac was collected and drug concentration was determined by HPLC method. Digoxin and verapamil were used to study the influence of p-glycoprotein on the absorption of puerarin. ResultsWith an increase of the concentration of puerarin, puerarin absorption across intestinal membrane was increased in the rat jejunum, ileum and colon, but there exited a saturable transport process for puerarin. With an increase of the concentration of verapamil and digoxin, puerarin absorption across intestinal membrane increased in the rat jejunum, ileum and colon, but when the concentration of digoxin and verapamil was 50 and 200 mg?L-1, the increase had a saturable process. ConclusionThe absorption of puerarin across intestinal sac may be an active transportation mediated by p-glycoprotein transporter.
Key words：Puerarin; Everted gut sac; Absorption; Verapamil; Digoxin
葛根素是从豆科植物野葛中提取的有效成分，有扩张冠脉、增加冠脉血流量、降低血压、减慢心率、降低心肌耗氧量等作用［1］。临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛并发呼吸道和肺部感染、眼底病、心肌炎等多种疾病。葛根素口服生物利用度差［2］是其口服给药的一大不足。药物的生物利用度不高可能是多种因素造成的，其中p-糖蛋白的外排作用是目前研究较多的因素之一。p-糖蛋白底物具有ATP依赖性的药物外排泵的功能，能将细胞内的药物泵出细胞外使细胞内的药物浓度降低［3］。肠管外翻模型在研究p-糖蛋白对药物吸收的影响因素方面文献报道较多［4］， ，因此，本研究旨在运用肠管外翻模型研究葛根素的吸收机制，探讨各肠段和p-糖蛋白抑制剂对葛根素吸收的影响。
1 仪器与材料
1.1 仪器Waters高效液相色谱仪（Waters 515泵，2487双波长紫外检测器，Rheodyne 7725i进样阀，CKChrom色谱工作站）（美国Waters公司）。
1.2 药物葛根素（含量：99.2%，烟台鲁银药业有限公司）；维拉帕米（天津制药厂）；地高辛（美国Sigma公司）；甲醇（色谱纯，淮阴汉邦科技有限公司）；其他试剂均为分析纯。
1.3 动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重200～220 g，沈阳药科大学实验动物中心提供。合格证号：辽实动质字033号。
2 方法与结果
2.1 实验模型的建立取三颈烧瓶，加入100 ml供试液（100 ml Krebs营养液含葛根素或葛根素与其它药物）作为供药体系。实验前将大鼠禁食过夜（不禁水），用20%的乌拉坦腹腔注射麻醉。沿腹中线打开腹腔，剪下实验的肠段，去除肠系膜，一端用细线扎紧，用细玻璃棒轻柔地将肠管翻转使黏膜面（A面）朝外，另一端绑扎于玻璃管一端，用注射器从玻璃管向肠内注满空白Krebs营养液，作为受药体系。然后将其放入三颈烧瓶中，受药体系液面高于供药体系液面，在烧瓶中通入气体（95%O2及5%CO2），整个装置放入37℃恒温水浴中进行实验。
2.2 分析方法建立
2.2.1 HPLC分析条件
流动相：甲醇-水（1∶2）；色谱柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）（DIKMA）；检测波长UV 250 nm；柱温：40℃；流速：1.0 ml?min-1。
2.2.2 方法的专属性
用空白营养液按“2.1”项下操作，收集肠内溶液。在上述色谱条件下，考察空白肠内液对葛根素是否有干扰。结果表明，空白肠营养液中的物质对葛根素色谱峰无干扰。见图1。
2.2.3 标准曲线
用营养液分别配制浓度为1，2，5，10，50，100和250 mg?L-1的葛根素溶液，于上述色谱条件下测定，将葛根素色谱峰面积对浓度进行线性回归，所得线性方程即为标准曲线方程：A=40 805C-5 766，R2=0.999 9。上述结果表明，葛根素在1～250 mg?L-1浓度范围内，色谱峰面积（A）与浓度（C）呈良好的线性关系。
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2.2.4 回收率和精密度
用空白营养液按“2.1”项下操作对各肠段进行实验，收集肠内溶液。以此溶液分别配制浓度为1，5，50和250 mg?L-1的葛根素溶液（各6份），依上法操作，按未知样本随标准曲线同时测定，计算葛根素的回收率和精密度。1，5，50和250 mg?L-1的葛根素溶液的回收率分别为101.8%，100.8%，99.3%和100.5%，其相应的RSD分别为3.9%，1.0%，1.3%和1.4%。
2.2.5 葛根素在肠营养液中稳定性
用空白营养液按“2.1”项下操作对各肠段进行实验，收集肠内溶液。以此溶液分别配制浓度为1，5，50和250 mg?L-1的葛根素溶液，置于37℃的水浴中孵育，定时取样，测定葛根素的浓度。浓度为1，5，50和250 mg?L-1的葛根素溶液在8 h内无明显变化，其相应的RSD分别为1.09%，0.57%，0.43%和0.63%，表明葛根素在肠营养液中能够稳定存在。
2.3 葛根素肠吸收实验用Krebs营养液配制含有浓度为2，10，50，100和250 mg?L-1的葛根素营养液对空肠、回肠和结肠进行实验，并分别于0.5，1，1.5，2 h取出受药体系溶液进行HPLC测定，并记录体积，同时补充空白Krebs营养液。用含100 mg?L-1的葛根素营养液配制含有5，20，50 mg?L-1地高辛溶液和10，100，200 mg?L-1维拉帕米溶液，并分别对空肠、回肠和结肠进行实验，于0.5，1，1.5，2 h取出受药体系溶液进行HPLC测定，并记录体积，同时补充空白Krebs营养液。
2.3.1 葛根素在各肠段的透过性分别以浓度为2，10，50，100和250 mg?L-1的葛根素营养液对各肠段进行实验。结果表明（见图2），各肠段对葛根素的透过性在较低浓度（<100 mg?L-1）时无显著性差异（P>0.05），而浓度达250 mg?L-1时各肠段具有显著性差异（P<0.05）；各肠段对葛根素的透过量与浓度呈非线性关系，提示葛根 素在各肠段的吸收有可能存在主动转运的过程。
2.3.2 p-糖蛋白抑制剂（地高辛、维拉帕米）对葛根素肠吸收的影响考察了葛根素浓度为100 mg?L-1时不同浓度的地高辛和维拉帕米对葛根素在各肠段的透过性。结果表明（见表1），加入地高辛和维拉帕米后，葛根素的肠黏膜透过性增加，且当地高辛和维拉帕米达到一定浓度时，肠黏膜的透药量基本保持不变，因此葛根素的肠吸收有可能存在主动转运的过程，此主动转运可被地高辛和维拉帕米抑制，由于地高辛和维拉帕米为p-糖蛋白抑制剂，因此可以初步确定葛根素肠吸收的主动转运载体可能为p-糖蛋白，这一载体具有外排泵的作用，可将药物从浆膜侧转运到黏膜侧。表1 地高辛和维拉帕米对葛根素肠吸收的影响（略）
3 讨论
本实验中曾经采用在体肠循环法（Recirculate perfusion method）和在体单向灌流法（Single-pass perfusion method）两种方法对葛根素的肠吸收进行了实验，结果发现，葛根素在大鼠肠黏膜的吸收差（4 h的累计吸收量<2%），其原因可能是：葛根素的8位碳上链有一个吡喃葡萄糖，由于空间位阻的原因使其不易透过肠黏膜；另外，在实验中采用了酚红作为灌流液体积变化的标示物，有研究表明［5］，在体肠循环实验中长时间的循环灌流酚红能够被小肠吸收，平均吸收速率约6%?h-1，说明酚红不适于在体肠循环实验中作为灌流液体积的标示物，否则将导致药物的固有吸收速率常数偏小，尤其是难吸收的药物。基于以上原因，本文采用了大鼠肠管外翻法考察了葛根素在肠黏膜的吸收性质。
在肠管外翻模型中，测定的是药物从肠黏膜侧（A面）到浆膜侧（B面）的透过量，这直接反映了药物在肠黏膜细胞层中的转运过程，主要包括：主动转运、促进扩散、被动扩散和胞饮作用，但前两者均需要有载体参与，因而该种转运过程存在饱和性。实验结果表明，葛根素在肠黏膜的透过性受浓度的影响，存在着自身浓度抑制作用，可知葛根素在肠黏膜的转运除被动扩散外，还可能存在主动转运过程。
地高辛和维拉帕米是p-糖蛋白的抑制剂，二者可抑制肠黏膜p-糖蛋白的活性，从而增加药物的吸收，但这种抑制作用存在着一定的饱和性，这正与本文实验结果相一致，从而进一步证明葛根素经肠黏膜的转运存在外排泵p-糖蛋白的作用。
【参考文献】
［1］吴凯. 葛根素注射液的临床应用［J］.天津药学，2002，14(6)：14.
［2］张志荣, 游学均, 魏振平, 等. 愈风宁心胶囊在兔体内的药动学和生物利用度研究［J］.中国药学杂志, 1997, 32(4):224.
［3］彭文兴, 汪新亮, 李焕德. 体内药物相互作用新位点-P-糖蛋白［J］.中国临床药理学杂志, 2001, 17(5):386.
［4］Barthe L, Bessouet M, Woodley J F. The improved everted gut sac :a simple method to study intestinal P-glycoprotein ［J］.Int J Pharm, 1998, 173(1):255.
［5］胡一桥，郑梁元，钱陈钦，等. 离子型药物酚红的小肠吸收研究［J］.中国药科大学学报, 1996, 27(6):355.