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【摘要】 目的：提取分离明党参多糖，分析明党参多糖的基本结构。方法：明党参水提取液，经乙醇分级沉淀得粗多糖，再经Sephadex G??200柱色谱分离纯化得明党参多糖Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。通过高效液相凝胶渗透色谱法测得多糖Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的平均分子质量分别为165200、10500、7600；由高效液相色谱、红外光谱、13C核磁共振、高碘酸氧化和Smith降解等方法分析其组成和化学结构。结果：多糖Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ均由葡萄糖组成，其苷键构型均为α苷键。结论：明党参多糖Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ为首次从该植物中得到。论文学术科研网
【关键词】 明党参多糖 提取分离 结构分析
明党参为伞形科植物明党参Changium smyrnioides Wolff.的根，研究表明，明党参及其多糖具有一定的扶正固本、增强免疫和适应原样作用，在防治癌症和感染等疾病上有潜在的应用价值，而明党参多糖为其活性成分之一，在药效上发挥着重要的作用［1］。因此，对明党参多糖进行提取分离及结构分析对进一步的深入研究具有重要意义。
1 仪器与试药
1.1 仪器 FLEXI??DRYmfMP冷冻干燥机(美国FTS公司)；BIO??TEK高效液相色谱仪 (美国BIO??TEK公司)；Alltech 500蒸发光散射检测器(美国Alltech公司)；752型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；LIBROR AEL24??SM电子分析天平(日本岛津)；IR100红外分光光度计(美国尼高力仪器公司)。
1.2 试药 明党参药材采自江苏句容，经南京中医药大学鉴定教研室陈建伟教授鉴定为伞形科植物明党参Changium smyrnioides Wolff.的干燥根；葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、鼠李糖等单糖标准品购自中国药品生物制品检定所；其他试剂均为分析纯。
2 提取分离
明党参药材500g，4000ml 95%乙醇提取，药渣用4000ml、2000ml蒸馏水分别煮沸2h,离心，上清液冷冻过夜。抽滤，滤液加热，浓缩，至即将出现固体时停止加热，上清液加入乙醇依次成30%、50%、70%的乙醇溶液，静置过夜，离心，离心沉淀物先后用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，于40℃真空干燥箱中干燥，即得30%、50%、70%醇沉多糖。取醇沉多糖配成饱和溶液，经Sephadex G??200柱色谱反复柱层析，依次用蒸馏水、0.1%、0.5%、1.0%的氯化钠水溶液梯度洗脱，用苯酚?擦蛩岱?检测洗脱曲线，50%、70%醇沉多糖分别得到白色粉末明党参多糖Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。
3 纯度及相对分子质量检测
3.1 电泳法检测各多糖的纯度 取琼脂糖175mg加热溶于25ml(0.05mol/L)1，6?布憾?胺缓冲液中，制胶，点上各多糖样品溶液，90V电泳3h，后用甲苯胺蓝染色60min，用乙醇脱色。电泳结果显示各多糖为单一斑点。
3.2 高效液相凝胶渗透色谱法(HPGPC)检测各多糖纯度和相对分子质量［2-4］
3.2.1 样品溶液的制备 取多糖Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ粉末各2mg，溶于1ml蒸馏水中，离心后即得。
3.2.2 标准品溶液的制备 取DEXTRAN T??1600，T??380，T??200，T??70，T??10和葡萄糖标准品各2mg，溶于1ml蒸馏水中，离心后即得。
3.2.3 色谱条件 色谱柱：TSK??gelG5000 PWxl(7.8mm×30cm，日本TOSOH公司)；流动相：纯净水；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；检测器：Alltech 500 ELSD；漂移管温度：110℃。
3.2.4 标准曲线 DEXTRAN T??1600，T??380， T??70， T??40，T??10和葡萄糖标准品分子量与保留时间呈良好的线性关系，标准曲线y=9.6391??0.4644x，r=0.9990。
3.2.5 结果 多糖在色谱分析图中呈现单一对称峰，说明各多糖为均一多糖组分。与标准葡聚糖对照，明党参多糖Ⅲ为均一多糖，平均相对分子质量为165200；多糖Ⅳ为均一多糖，平均相对分子质量为10500；Ⅴ和Ⅵ为同一均一多糖，平均相对分子质量为7600。
4 结构分析
4.1 HPLC色谱法分析各多糖的单糖组成［5-6］
4.1.1 色谱条件 色谱柱：lichrospher NH2；流动相：乙腈－水(80：20)；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测器：Allte ech 500 ELSD；飘移管温度：90℃。
4.1.2 样品溶液的制备 取各多糖粉末10mg，加2ml 1mol/L的H2SO4，封管105℃水解8h，碳酸钡中和，离心，取上清液，即得。
4.1.3 标准品溶液的制备 取葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、鼠李糖等单糖标准品各2mg，溶于1ml蒸馏水中，离心，取上清液，即得。
4.1.4 结果 对照标准品溶液色谱图，各多糖的完全酸水解产物HPLC色谱图在葡萄糖标准品保留时间均出峰，说明明党参多糖Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ均由葡萄糖聚合而成。
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4.2 IR、1H-NMR谱分析［7-8］
4.2.1 IR谱 各多糖未出现810cm-1和870cm-1的峰，进一步说明明党参多糖Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ结构中没有甘露糖；在840cm-1左右有峰，而890cm-1左右没有峰表明糖的苷键构型为α构型。
4.2.2 1H??NMR谱 1H??NMR谱端基碳位移值大于5.0，进一步证实糖的苷键构型为α构型。
4.3 高碘酸氧化和Smith降解反应［9-10］
4.3.1 NaIO4标准曲线的制备 精密称取NaIO4 4.96mg，定容至25ml，分别量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml至25ml容量瓶中，测定223nm处吸收值，以吸收值对浓度作标准曲线，呈良好的线性关系，标准曲线方程y=0.39718x+0.01280，r=0.9995。
4.3.2 葡萄糖标准曲线的制备 精密称取葡萄糖标准品16.1mg，定容至10ml，离心备用。色谱条件:色谱柱：lichrospher NH2；流动相：乙腈－水(80：20)；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测器：ELSD；飘移管温度：84℃。分别取上述葡萄糖标准品溶液2、4、，6、8、10μl进样，峰面积与浓度呈良好的线性关系，标准曲线y=44.06x-29.16,r=0.9998。
4.3.3 甘油标准曲线的制备 精密称取甘油标准品14.3mg，定容至10ml，离心备用。色谱条件同上。分别取上述甘油标准品溶液1、2、4、8、16μl进样，峰面积与浓度呈良好的线性关系，标准曲线y=27.93x+2.43，r=0.9997。
4.3.4 样品的测定 精密称取明党参多糖Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ约15mg，加一定量10mol/L高碘酸钠溶液，置于4℃阴暗处放置，间或振摇，分别于0、4、24、48h间隔取样稀释50倍后，223nm处测定光密度。随着高碘酸被消耗，光密度值逐渐下降，至达稳定值，加适量乙二醇搅拌30min，用0.01mol/L NaOH滴定确定产生的甲酸量。对流水透析48h，蒸馏水透析过夜，65℃减压浓缩至小体积，加入NaBH4，对流水透析过夜，冻干得多糖醇。取上述多糖醇，用1mol/l H2SO4水解，碳酸钡中和后离心，上清液进行HPLC鉴定。
4.3.5 结果 由A223变化值、甲酸量及HPLC分析检识可知，降解产物多糖Ⅲ的甘油：葡萄糖为6:1；多糖Ⅳ为4:3；多糖Ⅴ和Ⅵ为3.8：7.9；而均无赤藓醇。表明多糖Ⅲ由大量的1-6和1-2连接的葡萄糖组成主链，由1-3连接的葡萄糖组成支链形式；多糖Ⅳ由较多1-6和1-2连接的葡萄糖组成主链，而由1-3连接的葡萄糖组成支链形式；多糖Ⅴ、Ⅵ由1-6，1-2和1-3连接的葡萄糖组成。
5 讨论
5.1 本文建立了明党参多糖提取分离方法，阐明了明党参多糖的基本结构，为明党参多糖的进一步深入研究奠定了基础。
5.2 经检测，在30%醇沉部位也含有明党参多糖Ⅲ。从明党参中提取的多糖为中性多糖，经醇沉处理后紫外扫描在260nm和280nm处未见吸收峰，显示不含蛋白质和核酸，或者含量较低，此点与其他提取多糖不同。
5.3 (1)电泳法分析多糖的纯度时，由于样品分离和样品染色比较困难，考察多种显色方法，最后确定用1，6?布憾?胺缓冲液和甲苯胺蓝显色较好。(2)完全酸水解进行单糖组成分析时,用碳酸钡中和强碱环境,可保证水解产物仅为葡萄糖组成。
5.4 各均一多糖提取分离及结构分析参考其他多糖结构研究文献［2-6］,但高级结构还有待进一步研究,需借助二维核磁共振谱和部分水解后结构解析。
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