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【摘要】 目的 探讨柴胡疏肝散对肝纤维化大鼠模型α??SMA、TGF?拨?1的影响及其抗纤维化的机制。方法 采用40% CCl4皮下注射，制备肝纤维化模型并以柴胡疏肝散干预，测定肝功能、血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)及肝组织羟脯氨酸(HYP)，光镜观察肝组织病理变化，免疫组织化学法检测肝组织α??SMA、TGF?拨?1表达，RT??PCR 检测TGF?拨?1 mRNA 的表达。结果 柴胡疏肝散组较模型组:肝功能明显改善，血清HA及LN显著降低，肝组织HYP含量明显少，肝组织纤维化程度明显改善，肝组织α??SMA及TGF?拨?1表达减少。结论 柴胡疏肝散对CCl4 诱导的大鼠肝纤维化有良好的防治作用。
【关键词】 柴胡疏肝散；肝纤维化；α??SMA；TGFβ1
近年来柴胡疏肝散抗肝纤维化的临床研究取得了较好的临床效果〔1〕，但目前国内外尚无柴胡疏肝散抗肝纤维化的基础研究。本实验采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纤维化模型,观察柴胡疏肝散的抗肝纤维化作用,并探讨其对α?财交?肌肌动蛋白(α??SMA)、转化生长因子(TGF?拨?1)影响及柴胡疏肝散抗肝纤维化的理论机制。
1 材料与方法
1??1 材料
1??1??1 动物及药物 雄性22月龄Wistar 大鼠60 只,体重300～350 g，由吉林大学实验动物中心提供。柴胡疏肝散(柴胡6 g，陈皮6 g，川芎5 g，香附5 g，枳壳5 g，赤芍5 g，甘草3 g，由长春中医药大学附属医院提供) 经冷水浸泡药材2 h，常规两煎,头煎1??5 h，二煎1 h，两次水煎液混合并过滤,经水浴蒸发浓缩成含生药1??12 g/ml的浓缩药液冷藏备用。按体表面积折算,大鼠每天的柴胡疏肝散等效剂量为2??8 g/kg(体重) 。
1??1??2 药品及试剂 CCl4购自北京北化精细化学品有限责任公司)；秋水仙碱(colchicine) 购自昆明股份制药有限公司;谷丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒购自上海科欣生物技术研究所；血清总胆红素(TBIL)试剂盒购自上海科华东菱诊断用品有限公司；透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)放射免疫分析测定盒购自上海海军医学研究所生物技术中心；单克隆急用型鼠抗人生α??SMA试剂盒购自北京中杉生物公司，兔抗大鼠TGF?拨?1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫组化试剂盒购自福州迈新试剂公司，DAB购自北京中山生物公司，RT??PCR两步法试剂盒购自TAKARA公司，Trizol购自Sangon公司。
1??2 方法
1??2??1 模型制作 参照文献〔2〕方法：实验第1 天除正常空白对照组(对照组) 外,其余动物皮下注射CCl4 分析纯0??5 ml/100 g (体重),以后每隔3 d注射40% CCl4 橄榄油剂0??3 ml/100 g(体重),连续8 w。实验前2 w饲喂高脂玉米粉饲料(79??5%玉米粉+20%猪油+0??5%胆固醇)，第3～6周饲喂100%玉米粉和30%乙醇饮料。
1??2??2 分组及给药方法 将60 只大鼠随机分为4组,每组15只，第1组对照组,饲喂正常饮食;第2组模型组,按上述造模方法给予饮食;第3组柴胡疏肝散治疗组,于造模3 w开始,给予柴胡疏肝散煎剂灌胃,每日2??8 g/kg;第4组秋水仙碱组，于造模3 w开始给予秋水仙碱0??1 mg/(kg?d)-1，共8 w。
1??2??3 标本制作 上述造模及处理过程结束日，禁食12 h后称质量，股静脉取血，分离血清置-20℃保存;并立刻完整摘取肝脏及脾脏，称质量后用生理盐水漂洗肝左叶数次，滤纸拭干后，切取0??2 g置于冰浴中的组织匀浆器内，加入冰生理盐水2 ml，制备成100 g/L肝组织匀浆，4 000 r/min 4℃离心，取上清液保存于-20℃。肝右叶置于40 g/L中性甲醛液中常规固定后，石蜡包埋，用于制作组织芯片。
1??3 检测指标
1??3??1 血清及组织纤维化指标检测 测定血清肝功能包括总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、A/G，检测透明质酸(HA)，Ⅲ型前胶原(PCⅢ)，N型胶原(CN)，层黏蛋白(LN)含量(放射免疫分析法):肝匀浆检测羟脯氨酸(HYP)含量(二甲氨基苯甲醛法)，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，均按试剂盒说明书操作。
1??3??2 病理检测 组织芯片分别行常规HE染色，Masson三色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色，光镜下观察，并根据 据王泰龄等改进的肝纤维化半定量评分系统(SSS)〔3〕进行炎症活动度及肝纤维化程度计分。
1??3??3 免疫组织化学检查α??SMA、TGF?拨?1 采用石蜡包埋常规切片,SP法,兔抗鼠TGF?拨?1,多克隆抗体及鼠抗鼠α??SMA单克隆抗体均以1∶100 稀释,DAB 显色,苏木素复染。PBS 代替一抗作为阴性对照。阳性组织呈棕色，阴性组织呈蓝色?痹谌?自动图像分析系统上，采用HPIAS??2000型图像分析软件进行定量分析，随机选取每张切片10个视野(×400)倍测定阳性细胞的A值与所占视野面积，取其乘积平均值为该组织切片所得值，两项乘积越大表明组织中该抗原含量越高。
1??3??4 RT??PCR检测 大鼠GAPDH 上游引物:5′??CATGACCACAGTCCATGCCATC??3′,下游引物：5′??CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC??3′全长450 bp；TGFβ1 上游引物：5′??TGAGTGGCTGTCTTTTGACG??3′，下游引物：5′??ACTTCCAACCCAGGTCCTTC??3′全长350 bp。α??SMA上游引物：5′??AAGAGGAAGACAGCACAGCTC??3′,下游引物：5′??GATGGATGGGAAAACAGCC??3′称取50～100 mg 肝组织用Trizol 提取总RNA，采用分光光度法测定其含量及纯度，测定A260/A280 值。取2 μg 总RNA，42 ℃逆转录90 min。参数设置94 ℃变性,3 min ×1 循环。94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环。最后72 ℃彻底延伸7 min ×1 循环。同法扩增GAPDH 作为内参照。取5 μl PCR 产物1??5%琼脂糖凝胶电泳。凝胶图像分析系统检测灰度,TGF?拨?1/GAPDH 比值表示TGF?拨?1 mRNA 相对水平。α??SMA/GAPDH 比值表示α??SMAmR2NA 相对水平。
1??4 统计学分析 实验结果计量数据以x±s表示，经SPSS11??10软件包进行方差分析，组间比较采用t检验。
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2 结果
2??1 各组大鼠肝功能改变 模型组ALT 、AST 显著升高,ALB 显著降低；干预组ALT、AST 较模型组明显降低,ALB 则显著升高。见表1。
表1 大鼠血清肝功能的变化（略）
与模型组比较：1)P＜ 0??05，与正常组比较：2)P＜ 0??01
2??2 各组大鼠血清纤维化检查结果 与正常组相比,模型组大鼠肝纤维化各项指标明显升高(P＜ 0??01)，柴胡疏肝散干预组与模型组比较，HA、LN及PCⅢ明显降低(P＜ 0??01)，但未达到正常对照组的水平。肝组织HYP含量模型组与正常组相比明显升高(P＜ 0??01)，柴胡疏肝散干预组与模型组比较，明显降低(P＜ 0??01)。见表2。
表2 各组大鼠血清HA、LN、PCⅢ含量变化（略）
与模型组比较：1)P＜ 0??01，与正常组比较：2)P＜ 0??01
2??3 组织形态学改变 肝脏HE 染色显示,正常大鼠可见少量胶原着色,病理模型组肝小叶结构破坏,纤维组织增生明显,将肝小叶分隔成大小不等的肝细胞团,肝细胞广泛变性坏死,汇管区扩大、胶原沉积。柴胡疏肝散干预组肝细胞有不同程度的变性坏死,汇管区及小叶间有少量纤维组织增生,纤维间隔细小,与模型组比较差异显著。秋水仙碱干预组肝细胞有不同程度的变性坏死,汇管区及小叶间有少量纤维组织增生，肝细胞内可见脂肪沉积。统计分析，柴胡疏肝散干预组及秋水仙碱干预组较模型组纤维化程度较轻(P＜ 0??05)，Masson 染色胶原面积:模型组与柴胡疏肝散干预组相比分别为与(12??9±0??6)%和(6??2±0??4)%，柴胡疏肝散干预组较模型组为低(P＜ 0??01) 。见表3。
表3 大鼠肝纤维化的分级（略）
与模型组比较：1)P＜ 0??05,与正常组比较：2)P＜ 0??01
2??4 免疫组化结果 正常组肝组织中几乎不表达TGF?拨?1，模型组TGF?拨?1 阳性细胞主要位于中央小叶和门静脉周围纤维带及肝纤维间隔中,主要见于Kuffer细胞、类间质细胞质及其周围，柴胡疏肝散干预组阳性染色程度均较模型组明显减轻(P＜ 0??01) 。α??SMA在胞浆表达，正常对照组只表达于小动脉及小静脉，在胆管无表达。模型组α??SMA主要表达于汇管区及纤维间隔，且呈长椭圆形或 梭形。实验表明模型组α??SMA免疫组织化学染色面积明显升高，显著高于正常组(P＜0??01)。柴胡疏肝散治疗组及秋水仙碱干预组明显低于模型组(P＜ 0??05)。见表4。
表4 各组大鼠肝组织TGF?拨?1 及α??SMA表达的变化（略）
与模型组比较：1)P＜ 0??05,与正常组比较：2)P＜ 0??01
2??5 RT??PCR检测 正常肝组织几乎不表达TGF?拨?1 mRNA，而模型组为强表达，TGF?拨?1/GAPDH 比值为0??84±0??17，远高于正常组(P＜0??01)；柴胡疏肝散干预组TGF?拨?1/GAPDH比值为0??57±0??14，TGF?拨?1 mRNA 表达低于模型组(P＜0??05)。α??SMA mRNA模型组表达较正常组明显增强，比值为0??97±0??15(P＜0??01)；柴胡疏肝散干预组比值为0??62±0??23，与模型组比较(P＜0??01)。
3 讨论
目前的研究认为，肝纤维化的病理改变是细胞外基质(ECM)的增生和降解失衡所致，而病理情况下细胞外基质的主要细胞来源是肝星状细胞(HSC)，他的激活和增生在肝纤维化过程中起主要作用〔4，5〕。TGF?拨?1是HSC活化的强有力刺激因子和肝纤维化形成的始动细胞因子〔6，7〕，α??SMA是HSC活化的标志〔8〕。从祖国医学辨证认为，肝纤维化是由于气滞、血瘀、络阻所致，肝纤维化初期主要为气滞，进而血瘀，最后络阻，气机不畅，肝纤维化、肝硬化形成。因而，在肝纤维化早期给予理气治疗，间以活血可有效地阻止肝纤维化的形成，柴胡疏肝散(源自《景岳全书》)主入肝经，方用陈皮、柴胡、川芎、香附、枳壳疏肝理气，川芎、赤药活血化淤，共奏理气活血之功效，是防治肝气淤滞的有效验方。本实验证实了柴胡疏肝散具有保护鼠肝功能的作用，ALT、AST较模型组明显降低，ALB较模型组明显升高，两者比较差别显著；血清中各纤维化指标及肝组织羟脯氨酸含量柴胡疏肝散组较模型组明显降低；柴胡疏肝散从组织学上具有减少试验鼠肝纤维?形成的作用，病理HE染色，Masson三色染色胶原含量较模型组明显降低，病理分级明显改善，两者比较差别显著；柴胡疏肝散能够减少或阻抑试验鼠TGF?拨?1及α??SMA的表达，免疫组化及RT??PCR证实TGF?拨?1及α??SMA的表达量较模型组明显降低，两者比较差别显著，柴胡疏肝散具有防治实验鼠肝纤维化的作用。
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