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作者：赵晋波，李小飞，刘锟，周勇安，梁志波，程庆书 【关键词】 气管移植；小鼠,近交系；疾病模型,动物
Establishment of an orthotopic tracheal transplantation model with inbred mice
【Abstract】 AIM： To establish an orthotopic tracheal transplantation model with inbred mice. METHODS: Weightmatched inbred mice with different germlines were randomly assigned to 2 experimental groups: A,C57BL/6（donator） → BALB/c（receptor）(n=10 pairs); B, BALB/c（donator） →BALB/c（receptor）(n=10 pairs). Weightmatched Kunming(KM) mice were assigned as a control group C: KM(donator)→ KM(receptor) (n=10 pairs).The orthotopic tracheal transplantations were performed according to the designed groups and the transplanted trachea was coated with the anterior cervical muscles for revascularization.Tracheal graft rejection was monitored by daily clinical airway assessment, histological examination using HE staining and scanning electron microscopy. RESULTS： All the mice in group A and B were living until they were sacrificed, while 6 mice kept alive in group C. Tracheal autografts in group A and C had notable rejection reaction,but group B did not.In the 3 groups, the epithelial scores were 1.094±0.120,2.872±0.059 and 0.995±0.444; the numbers of lymphocyte were (20.18±1.31) /HPF, <5 /HPF and( 22.55±4.87) /HPF; the ratios of anuclear chondrocyte/osteocyte were (27.22±1.09)%, (10.60±1.01)% and (31.40±6.43)%. Various cellular indexes such as the epithelial score, the number of lymphocyte and the ratio of anuclear chondrocyte/osteocyte in group A and C showed marked statistical difference when compared with those of group B, but no statistical difference was found when group A was compared with group C. CONCLUSION： A C57BL/6（donator） → BALB/c（receptor）orthotopic tracheal transplantation model has been established successfully.Various pathophysiological changes in the tracheal transplantation would well be reflected in both the inbred and closed population mice.The inbred model seems to be more s stable than the closed population.
【Keywords】 trachea transplantation; mice, inbred strains; disease models, animal
【摘要】 目的： 建立近交系小鼠同种异体原位气管移植模型. 方法： 供受体体质量配对后，C57BL/6 和BALB/c小鼠随机分为2组，每组各10对，A组为C57BL/6（供体） → BALB/c（受体）组，B组BALB/c（供体） →BALB/c（受体）组，昆明种小鼠10对作为C组即KM（供体） →KM（受体）组. 利用颈前肌肉及周围组织被覆移植气管提供血供建立同种异体小鼠原位气管移植模型. 使用HE染色以及扫描电镜对同种异体小鼠原位气管移植模型进行评估，观察比较上皮积分、淋巴细胞计数以及无核软骨细胞/全部软骨细胞等指标. 结果： A, B组全部存活，C组存活6只. A, C组移植气管均发生一定程度的排斥反应，B组无排斥反应发生. A, B, C三组上皮积分分别为： 1.094±0.120分，2.872±0.059分及0.995±0.444分；无核软骨细胞数/骨细胞总数比值分别为：（27.22±1.09）%, （10.60±1.01）% 及（31.40±6.43）%；淋巴细胞计数分别（20.18±1.31）个/HPF，≤5个/HPF及(22.55±4.87)个/HPF. A, B组及C，B组各项指标相比均有统计学意义，而A，C组相比则差异无统计学意义；且C组各数值离散程度均大于A组. 结论： 成功建立了C57BL/6（供体） → BALB/c（受体）小鼠原位气管移植模型. 近交系及封闭群模型均能反应移植气管的各种病理生理变化，但封闭群模型稳定性较近交系差. 【关键词】 气管移植；小鼠，近交系；疾病模型，动物
0引言 气管移植是气管重建外科的重要研究方向. 以往主要采用杂交犬，家兔等动物作为模型进行同种异体原位或异位移植的研究［1-2］. 由于应用的实验动物为非近交系，遗传背景不明确，使研究只能局限于大体形态及镜下病理学的观察，无法进行更为精确的免疫学方面的观察和研究. 为了解决这一问题，本实验我们建立了同种异体近交系小鼠原位气管移植模型，并对近交系小鼠原位气管移植模型和封闭群小鼠原位气管移植模型进行对比性研究.
1材料和方法
1.1材料清洁级C57BL/6， BALB/c，昆明种（KM）小鼠各20只（第四军医大学实验动物中心，体质量25～30 g，雄性）. 供受体按体质量对成30对后随机分为3组: A组: C57BL/6（供体） → BALB/c（受体）组（n＝10）；B组：BALB/c（供体） →BALB/c（受体）组（n＝10）；C组：KM（供体） →KM（受体）组（n＝10）. 术前不禁食水，术后灯照保暖3 h，禁食水6 h. 供受体均为清洁手术. 速眠新Ⅱ（军需大学军事兽医研究所）肌肉注射麻醉，缝合采用90尼龙缝线（上海精仪医疗器械厂）. 手术在显微镜（GSXⅡ手术放大镜，天津光学仪器厂）下进行，双人操作.
1.2方法速眠新Ⅱ， 1 mL/kg肌肉注射麻醉. ① 供体手术： 供体取颈前正中切口，游离气管，取6个软骨环长度气管一段，4℃生理盐水冲洗，供体在4℃生理盐水中准备，去除肌肉等组织备用. ② 受体手术： 同供体手术，游离气管，于环状软骨下第4个软骨环处切开气管，先不切断，将供体气管尾侧同受体尾侧气管12点处缝合一针，暂不打结，完全切断气管，分别于尾侧气管4点及8点方位各缝合一针，注意供受体气管对合整齐，最后将12点处缝线打结. 保持受体小鼠呼吸平稳，将头侧受体气管剪除2个气管环，照前述方法缝合头侧气管，将两侧颈部肌肉覆被移植气管后缝合. 将颌下腺向下牵拉覆盖术野，缝合皮肤.
1.3检测指标① 手术时间及存活情况. ② 大体表现. ③ 病理学观察:苏木素伊红染色后光镜观察. ④ 移植后上皮超微结构：取移植后35 d气管，固定，干燥后喷金，用扫描电镜（S520，日本日立公司）观察移植气管中段上皮生长及分化情况. ⑤ 根据Nakanishi等［3］标准进行评分： 0分(无上皮覆盖)；1分(单层上皮覆盖)；2分(复层上皮覆盖)；3分（正常假复层纤毛柱状上皮覆盖）. 观察各上皮覆盖的长度占总观测长度的百分比，以两者乘积的和为上皮积分. ⑥ 软骨破坏程度：随机计数6个高倍视野（×400）下无核软骨细胞及软骨细胞总数，计算无核软骨细胞数/软骨细胞总数，计算其平均值. ⑦ 淋巴细胞浸润程度：随机计数6个高倍视野（×400）下淋巴细胞数，计算其平均值.
统计学处理： 计量数据用x±s表示. 组间比较采用ANOVA，组间方差不齐时采用KruskalWalllis H检验. 采用SPSS11.5统计软件包处理数据，以P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1实验动物手术时间及存活情况所有手术时间均未超过70 min. A组： 全部存活至预杀期35 d. 术后第2～3日开始出现哮鸣音，第8～9日达到最重，然后稍有缓解，但到预杀期一直存在；B组： 全部存活至预杀期. 术后第2日有2只小鼠出现哮鸣音，5 d后缓解，其余小鼠未出现哮鸣音. C组： 术后第3, 14日分别有2只小鼠死亡，死因均为呼吸困难，其余全部存活至预杀期. 术后第2～3日开始出现哮鸣，第7～8日达到最重，一直持续到预杀期，缓解不明显.
2.2移植后气管大体表现A组： 吻合口愈合良好，移植气管周围为颈部肌肉所覆被，软骨轻度软化，形态较完整，管腔略狭窄；B组： 吻合口愈合良好，移植气管周围为颈部肌肉所覆被，软骨无软化，形态完整，管腔无狭窄；C组： 第3日死亡的2只小鼠头侧吻合口黏膜下水肿严重，堵死管腔，软骨轻度软化，第14日死亡的2只小鼠吻合口严重狭窄，移植段气管中间软骨软化，塌陷，不能维持正常通气，其余小鼠吻合口愈合尚可，移植段气管轻度软化，中间段狭窄，但尚能维持通气.
2.3移植气管病理学表现A组： 镜下可见吻合口较近部位为假复层纤毛柱状上皮，其余为单层及复层上皮，无纤毛，黏膜下层有大量淋巴细胞浸润，软骨中央部分变性、坏死，周围软骨膜下软骨细胞分裂增殖明显（图1A）. B组： 镜下见移植段气管上皮完整，为假复层纤毛柱状上皮，无脱落，黏膜下层淋巴细胞浸润较少，软骨形态完整，无坏死（图1B）. C组： 第3日死亡的2只小鼠气管上皮较完整，黏膜水肿严重，黏膜下中等量淋巴细胞浸润，软骨开始出现轻度变性，第14日死亡的2只小鼠移植段气管中间软骨坏死，红染，部分软骨形态消失，黏膜下大量淋巴细胞浸润. 其余小鼠移植气管上皮脱落坏死，少许鳞状上皮覆盖吻合口，黏膜下大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润. 软骨细胞坏死严重，部分软骨中间部正常结构不能分辨，周围软骨膜下少量软骨细胞分裂增殖（图1C）.
2.4移植后上皮超微结构A组可见纤毛稀疏，中间散在黏液细胞（图2A）；B组见纤毛浓密，几乎全部掩盖黏液细胞（图2B）；C组同A组相似，纤毛短而稀疏，散在黏液细胞（图2C）.
2.5上皮积分B组与A，C组上皮积分比较有统计学意义［（2.872±0.059） vs （1.094±0.120）和（0.995±0.444）， P<0.05）］，而A，C两组则无统计学意义［（1.094±0.120） vs（0.995±0.444）（P>0.05）］. C组数值离散程度大于A组.
2.6软骨破坏程度B组与A组及C组指标（无核软骨细胞/所有软骨细胞）相比有统计学意义［（10.60±1.01）% vs（27.22±1.09）%和（31.40±6.43）%， （P＜0.05）］,A, C组之间则无统计学意义［（27.22±1.09）% vs （31.40±6.43）%，（P>0.05）］. C组数值离散程度大于A组.
图1组织病理学表现 HE×100 略
论文参考网 2.7淋巴细胞计数A, C两组淋巴细胞浸润明显，分别为20.18±1.31?/HPF， 22.55±4.87个/HPF，而B组则很少见淋巴细胞浸润，≤5个/HPF. A, C两组无统计学意义（P>0.05）. 但C组数值离散程度大于A组.A： C57BL/6（供体） → BALB/c（受体）；B： BALB/c（供体） →BALB/c（受体）；C： KM（供体） →KM（受体）.
图2移植后上皮超微结构×2000 略
3讨论
在大器官移植稳步发展的今天，气管移植的研究及应用却停滞不前，一个重要的原因是缺少一种可靠的遗传背景明确的原位气管移植动物模型. 在国外，Genden等［4-5］于2002年首先建立了近交系小鼠的原位气管移植模型，并在此模型基础上进行了一系列卓有成效的研究，而我国则还没有相关方面的报道.
在参照Genden等［4-5］的方法的基础上，我们应用国内饲养的C57BL/6及BALB/c近交系小鼠分别作为供受体在国内首次建立同种异体气管移植模型，并首次比较近交系小鼠模型同封闭群之间的差别. 试验中我们尝试应用Genden等的方法进行气管移植，但预实验中短期内动物死亡率较高，解剖发现一个关键的原因是由于在原有气管长度的基础上再增加移植了6个气管环，导致气管容易打折，造 成动物窒息，因此我们对其进行了改进，将受体移植气管去除2个气管环，然后移植6个气管环的供体气管，这样既保证了吻合口处于无张力状态，又保证了移植气管不易打折，有利于移植气管的存活，实验证实，改进后短期动物全部存活. 实验中近交系移植组存活率均达到100％，而封闭群移植组存活率为60％，于术后第3日及第14日分别有2只小鼠死于呼吸困难. 利用上皮积分、淋巴细胞计数以及无核软骨细胞/所有软骨细胞全面评估移植气管的病理状况：A，B组及C，B组各项指标相比均有统计学意义，表明A，C组均能很好地反映移植排斥及上皮、软骨再生等一系列病理、生理变化. A，C组间各项指标无统计学意义，但是A组各项指标的离散程度同C组相比变异较小，表明A组能够更稳定的进行模型的复制，这可能是由于近交系小鼠个体间差异较小，而封闭群小鼠间则不具有这种基因的稳定性所致［6］. 由此可见近交系小鼠同封闭群相比可应用性更高，能够进行更精确，重复性更好的研究，并且由于近交系小鼠遗传学背景明确，检测方法及手段较多，因此更有利于评价气管移植后各种组织再生、免疫排斥、以及再血管化等病理生理变化. 移植气管的血液供应是气管存活的重要条件，在以往的研究中，人们尝试了多种的解决血供的方法，包括大网膜包绕［7］，肌瓣包绕［8-9］等. 但是在本实验以及Genden等［4-5］的实验中，均没有对小鼠的移植气管做进一步处理，只是在手术中将颈前部肌肉拉拢覆被移植气管，但是小鼠存活情况良好，在解剖小鼠的过程中可见周围覆被的肌肉组织同移植气管紧密相连，有血管长入移植气管. 这种不同于大动物如狗等模型的表现可能是由于动物种属不同，小鼠的组织再生能力较强所致. 本实验我们成功建立了同种异体原位气管移植模型，该方法不需要贵重器材，手术时间短，方法简单易于掌握，移植后动物存活率高，能够很好模拟同种异体原位气管移植后的病理生理变化，并且由于移植动物采用研究较多的近交系小鼠，其遗传背景明确，用于进一步检测的多种抗体已经商品化，有利于进一步研究的展开.
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